INS1E
Em seguida foi medido o efeito dos anticorpos monoclonais acima descritos no stress oxidativo e viabilidade das células INS1E.
Na figura 23 estão apresentados os resultados do efeito das IgM monoclonais na presença ou na ausência das citocinas pro-inflamatórias na libertação de espécies de oxigénio reactivas pelas células INS1E.
1 3 4 2 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 nº grupo experimental nº /estímulo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Células + + + + + + + + + + Citocinas 1/2 1/4 1/8 1/4 1/4 1/4 Acs P1-G1.12 P2-C1.2 HP10 P1-G1.12 P2-C1.2 HP10
Figura 23 – O efeito das IgM monoclonais sozinhos ou na presença de citocinas pro-inflama- tórias na produção de ROS nas células INS1E.
Cada grupo experimental foi feito em quadriplicado e os gráficos representam o aumento da produção de ROS estimulada por incubação com anticorpos monoclonais, de 2 ug/ml isolados ou com 15 U/ml de IL1-β, 46.3 U/ml de TNF-α e 3.5 U/ml de IFN-γ, durante 24h, em relação ao valor da média do controlo não estimulado. A linha horizontal indica a média dos
quadriplicados e a linha vertical indica EPM em cada condição. U. a., unidades arbitrárias.
O efeito dos anticorpos sozinhos ou em combinação com as citocinas foi comparado com o controlo negativo constituído por células não estimuladas e com o controlo positivo constituído pelo estímulo com as citocinas na sua concentração óptima. A curva de titulação das citocinas foi usada como controlo positivo para a estimulação celular. O efeito na libertação de ROS por estimulação com citocinas ocorreu conforme o esperado e foi significativo em comparação com as células não estimuladas. Observou-se que, a quantidade de espécies de oxigénio é tanto maior quanto maior for a concentração das citocinas. O efeito da incubação durante 24h com 2 µg/ml dos anticorpos monoclonais IgM P1G2.12, P2C1.2 e HP10,foi de um ligeiro aumento na libertação de ROS comparativamente com as células não estimuladas. No entanto, este efeito não é estatisticamente significativo e foi idêntico tanto para os anticorpos com reactividade para as células β (P1G2.12 e P2C1.2) como para o anticorpo controlo não reactivo (HP10). Observou-se que o efeito produzido nas células pela combinação do estímulo com os anticorpos monoclonais com a dose óptima de citocinas (¼ -15 U/ml de IL1β, 46,25 U/ml de TNFα e 3,5 U/ml de IFNγ) em comparação com o controlo negativo e com as células que foram incubadas apenas com IgM monoclonais foi maior mas não diferiu dos níveis de ROS libertados por células estimuladas apenas com a dose óptima de citocinas (¼).
Na figura 24 estão apresentados os resultados do efeito das IgM monoclonais com ou sem as citocinas pro-inflamatórias na viabilidade das células INS1E.
nº /estímulo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Células + + + + + + + + +
Citocinas 1/4 1/8 1/4 1/4 1/4
Acs P1-G1.12 P2-C1.2 HP10 P1-G2.12 P2-C1.2 HP10
Figura 24 – O efeito das IgM monoclonais sozinhos ou na presença de citocinas pro-inflama- tórias na viabilidade das células INS1E.
Cada grupo experimental foi feito em quadriplicado e os gráficos representam alteração na viabilidade nas células estimuladas com anticorpos monoclonais, de 2 ug/ml isolados ou com 15 U/ml de IL1β, 46.3 U/ml de TNFα e 3.5 U/ml de IFNγ, durante 24h, em relação ao valor da média do controlo não estimulado. A linha horizontal indica a média dos quadriplicados e a linha vertical indica EPM, em cada condição.
O controlo negativo das células não estimuladas define 100% da viabilidade neste ensaio. Observamos diminuição da viabilidade na presença da concentração óptima de citocinas ¼. Nesta experiência o valor da média para a viabilidade correspondente à diluição ½ das citocinas caiu fora da curva da titulação e como tal não está representada. A razão para este resultado é a quantidade das réplicas ser reduzida (2 réplicas). No caso da diluição ¼ e 1/8, as médias da viabilidade foram calculadas com quatro réplicas. Como esperado, O efeito na viabilidade demonstrou depender da concentração das citocinas, sendo que mais citocinas causam mais células morre, ou por outras palavras, diminuem a viabilidade.
O efeito na viabilidade celular causado por Anticorpos monoclonais P1G2.12, P2C1.2 não apresentou qualquer significância em termos estatísticos ao comparar com o controlo negativo. O efeito nas células que foram estimuladas com anticorpos e citocinas mostrou ser ligeiramente mais baixo em comparação com os anticorpos isoladamente mas idêntico ao efeito da dose óptima de citocinas. A figura 25 mostra os resultados da produção e libertação do nitrito pelas células INS1E na presença das IgM monoclonais sozinhas ou com citocinas pro-inflamatórias.
nº /estímulo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Células + + + + + + + + +
Citocinas 1/4 1/8 1/4 1/4 1/4
Acs P1-G1.12 P2-C1.2 HP10 P1-G2.12 P2-C1.2 HP10
Figura 25 – O efeito das IgM monoclonais sozinhos ou na presença de citocinas pro-inflamatórias na produção do nitrito nas células INS1E.
Cada grupo experimental foi feito em quadriplicado e os gráficos representam o aumento do nitrito nas células estimuladas por incubação com anticorpos monoclonais, de 2 ug/ml isolados ou com 15 U/ml de IL1-β, 46.3 U/ml de TNF-α e 3.5 U/ml de IFN-γ, durante 24h, em relação ao valor da média do controlo não estimulado. A linha horizontal indica a média dos quadriplicados e a linha vertical indica EPM, em cada condição.
No controlo negativo (apenas as células) foram detectadas quantidades baixas do nitrito no sobrenadante, correspondentes ao limite de detecção do método. A curva de titulação das citocinas apresentou um ponto fora da curva, que corresponde à concentração do analito referente a diluição ½ das citocinas. A razão para tal foi acima descrita, O efeito da diluição ¼ das citocinas foi significativamente alto comparando com as células não estimuladas. Por sua vez, o efeito produzido pela diluição a 1/8 foi significativamente mais baixo que o da diluiçao ¼ no entanto não se observou a diferença deste grupo experimental comparando com o controlo negativo. A presença de anticorpos isoladamente não levou a produção significativa de nitrito. O efeito produzido pelos anticorpos e citocinas em conjunto pode ser atribuído ao efeito das citocinas.