A primeira parte do trabalho experimental efectuado no âmbito desta tese visou esta- belecer ensaios in vitro em linhas celulares para testar se a presença de Acs mono- clonais do tipo IgM com reactividade para células β induz ou potencia o stresse oxi- dativo nestas células. Para este propósito foram utilizadas linhas de celulas β de rato INS1E e BRIN-BD11 e os ensaios para doseamento de ROS e do óxido nítrico (ON), na forma de nitrito.
Os protocolos para stress oxidativo e viabilidade celular foram optimizados para a concentração óptima das sondas utilizadas e o tempo da sua incubação. Após o passo da optimização, em ambas as linhas celulares testou-se a capacidade de res- posta a agentes de stress conhecidos, nomeadamente, H2O2 e saponinas. Logo ob- servou-se que, células β provenientes da linha INS1E são mais sensíveis às condi- ções de stress. As citocinas pro-inflamatórias podem estar presentes com abundância nos locais da inflamação mediada pelas células T CD4+ e outras células do sistema imunológico. O balanço entre citocinas pro- e anti-inflamatórias pode exacerbar ou cessar a resposta inflamatória local 12. Utilizou-se uma combinação de citoquinas pro- inflamatórias que induzem stress oxidadtivo e diminuição da viabilidade em células β10,95,96, por forma a optimizar os ensaios.
Definimos como dose óptima de citoquinas a diluição de ¼ que corresponde a uma dose em que ocorre diminuição de viabilidade e aumento da produção de ROS e ni- trito mas em que um efeito adicional provocado pela combinação de citocinas e anti- corpos poderia ser observado.
Uma vez estabelecidos os ensaios de stress e viabilidade celulares, estes foram utili- zados para testar a acção dos IgM monoclonais nas células β. Previamente, demons- trou-se a ligação destes Acs aos ilhéus do ratinho NOD e indução da maior expressão do gene iNos 72, responsável pela produção do óxido nítrico acima dos níveis fisioló- gicos benéfico 69,89. O ON constitui um mediador celular importante. A produção do ON dentro de níveis baixos assegura os eventos fisiológicos importantes para célula. eNos é o gene de expressão constitutiva, que permite portanto a manutenção da con- centração benéfica de ON. Por sua vez, o gene iNos, ao ser activado desencadeia processos que podem levar a morte celular. Vários mediadores da inflamação, nome- adamente, ácidos gordos de cadeia longa, citocinas proinflamatórias, estado hipergli-
cémico podem activar expressão de iNos via activação do factor de transcrição nu- clear NF-kB. O aumento consequente da ON pode induzir o severo stress do reticulo endoplasmático e apoptose 55.
Além da indução de maior expressão de iNos, Acs monoclonais foram capazes de se ligar às células INS1E e BRIN-BD11 in vitro 72.
Em relação a uma resposta funcional, não se observou nenhuma alteração significa- tiva nos níveis da insulina secretada após o estímulo da glucose na presença de IgM nas células BRIN-BD11. A ausência de efeito não se deve a dose de IgM utilizada já que foram testadas duas concentrações 10 μg/ml e 25 μg/ml de cada Ac monoclonal e não se observaram alterações significativas (este resultado não foi representado). O intervalo das concentrações escolhidas para Acs foi de acordo com os intervalos escolhidos nos ensaios de ligação de IgM monoclonais aos ilhéus do NOD. Assim, nesta linha celular os Acs não inibem a produção de insulina face ao estímulo de glucose. Contudo, a resposta das células BRIN-BD11 a um estímulo de glucose é bastante inferior à resposta de um ilhéu, pelo que este ensaio teria de ser reproduzido numa outra linhagem mais sensível à estimulação.
Tendo em conta os resultados da secreção da insulina nas células BRIN-BD11, e as evidências da maior sensibilidade das células INS1E na resposta ao stress, optou-se pela linha celular INS1E como o modelo in vitro para testar se a ligação do Ac às INS1E seria suficiente para aumentar expressão de ROS e produção de ON ou afec- tar a viabilidade.
A presença de citocinas inflamatórias levou a um aumento da produção de ROS, ni- trito e diminuição da viabilidade como esperado 97, contudo a presença de Acs mono- clonais isolados não levou a alterações ao nível de stress e viabilidade nas células β. Colocámos a hipótese de que a combinação da presença de Acs com outros estímu- los pro-inflamatórios, nomeadamente das citocinas e complemento poderiam induzir stresse oxidativo.
O efeito do complemento associa-se com a função da opsonização dos antigénios pelas imunoglobulinas. O complemento facilita portanto a formação dos complexos Ac-Ag 1. Contudo, não se observaram alterações ao nível de produção de ROS, ON e viabilidade nas células β após serem estimuladas com Acs na presença de citocinas pro-inflamatórias, complemento ou citocinas com o complemento.
Podemos concluir que a presença dos anticorpos IgM monoclonais não levou a alte- ração do estado das células INS1E. É possível que estes Acs não produzam efeitos directos nas células β. Os Acs monoclonais aqui utilizados podem não ser os clones representativos da população toda de IgM naturais, pelo que não é possível excluir a ausência de efeito directo de outro tipo de anticorpo. O mecanismo de acção dos AAcs, não está totalmente esclarecido 98. Os resultados obtidos neste estudo suge- rem que os anticorpos não actuam de forma directa na célula β embora possam de- sempenhar um papel importante na estimulação da resposta inflamatória 10. Em estu- dos prévios apontaram para o papel patogénico dos anticorpos anti-insulina transpal- centários no ratinho NOD. No entanto, parece que a expressão dos IgM ligados a membrana no NOD contribui mais para DT1 comparando com IgM secretadas 98,99. Foi também demonstrado que em determinadas circunstâncias, os Acs contra os ilhéus foram capazes de suportar a sobrevivência e proliferação dos T CD4+ auto- reactivas 98. Por outro lado as células B actuam via captação dos AAgs por BCR, e desempenham uma função das APCs às células T 57,100.
Por outro lado é possivel que, as células INS1E, sendo uma linha celular mais sensí- vel sejam mais resistentes à acção dos AAcs do que células β primárias. Para excluir esta hipótese teríamos de testar o efeito dos anticorpos em células β isoladas a partir de ilhéus de Langerhans de ratinho. Entretanto numerosas publicações relacionadas com DT1 utilizam precisamente esta linha celular como o modelo in vitro 76. INS1E foi uma linha optimizada a partir da pré-existente; secreta insulina em resposta ao estí- mulo da glucose nos intervalos próximos das células do rato e é bastante fácil de manter em cultura 76. Neste trabalho em particular, INS1E mostraram a reprodutibili- dade dos efeitos de ROS, ON e níveis de viabilidade, observados nas diferentes ex- periências com titulação das citocinas. A resposta observada pela quantidade relativa dos analitos (excepto no caso de ON, expresso em unidade absolutas de concentra- ção) foi dependente da dose das citocinas pro-inflamatórias.
A segunda parte do trabalho experimental consistiu no doseamento e a análise de associação genética dos níveis totais de IgM em doentes com DT1 e familiares com polimorfismos genéticos no locus do da cadeia pesada do IgM (IgH).
Previamente, foram identificados SNPs dentro da região IgH humana (mais especifi- camente, IgHM) e sua associação a DT1. Após o doseamento sérico de IgM anti- GAD, cujos níveis foram mais altos nos doentes diabéticos em comparação com os seus familiares, foram efectuados testes de associação dos níveis de anti-GAD aos SNPs referidos. O resultado demonstrou que, níveis séricos de IgM anti-GAD nos
doentes estão associados aos polimorfismos no locus IgH. Foi sugerido portanto, que a variabilidade genética dentro desta região genómica pode controlar a reactividade dos IgM anti-GAD 71.
Para excluir uma possibilidade de que níveis de IgM anti-GAD nos doentes dependem apenas dos níveis de IgM totais mais altos, foram doseados níveis totais de IgM no soro dos doentes e seus familiares. Após os ensaios de ELISA, efectuados em cinco dias, procedeu-se a normalização de dados. Uma vez obtidas as concentrações finais das IgM séricas, fez –se a comparação entre o grupo de doentes e familiares. O re- sultado mostrou que, o nível de IgM total no soro dos doentes é significativamente mais alto em comparação com o nível, observado nos familiares. O teste de correla- ção entre as variáveis IgM total e IgM anti-GAD demonstrou uma correlação positiva no grupo dos familiares saudáveis, mas não no grupo de doentes. Ou seja, os doentes com IgM total alta têm IgM anti-GAD baixa e vice-versa, o que significa que a quanti- dade de IgM anti-GAD não altera da mesma forma que IgM total. Estes resultados sugerem que, os doentes podem apresentar um repertório de IgM anti-GAD especí- fico, não definido pelas alterações das IgM totais no soro. A análise da associação genética QTL demonstrou que, os SNPs do locus IgH, previamente associados a DT1 e a auto-reactividade, não estão associados as IgM totais nos doentes e famili- ares saudáveis. Desse modo, a variabilidade no locus IgH, particularmente no seg- mento IgHM da cadeia pesada das Igs, pode controlar o repertório auto-reactivo de IgM, que não sendo dependente da IgM total, está codificado na linha germinal dos doentes e dos seus familiares próximos. Assim, a variabilidade do locus IgH humano, particularmente no segmento que codifica a cadeia µ das Igs, constitui mais um factor de susceptibilidade para DT1.