4.5 Variable Importance
4.5.2 Variable Importance for GLMs and Random GLMs
A fim de investigar a estabilidade dos com plexos form ados pela β-t ripsina e α-quim otripsina com o BTCI , foram realizados os experim ent os de desnat uração t érm ica ut ilizando a t écnica de dicroísm o circular na faixa distante do ultra violeta ( 190–260 nm ) . Os valores das elipticidades na faixa de tem peratura de 25-95oC m edidas em 208 nm , correspondent es a um a das bandas dicróicas caract eríst icas para est rut uras em a-hélices, foram consideradas para a análise das estruturas secundárias e cálculo dos parâm etros term odinâm icos que caracterizam a estabilidade térm ica das prot eínas.
Figura 3 9 . Curvas de desnaturação térm ica das proteínas: tripsina,
quim ot ripsina, BTCI em com plexo binário com quim ot ripsina, com tripsina e com plexo ternário com am bas as enzim as, em pH 7,0.
Figura 4 0 . Fração desnat urada t erm icam ent e das proteínas: tripsina,
quim ot ripsina, BTCI em com plexo binário com quim ot ripsina, com t ripsina e com plexo t ernário com am bas as enzim as, em pH 7,0.
A figura 40 apresenta as curvas de transição térm ica aj ust adas segundo os valores das frações desnat uradas das prot eínas estudadas. A partir desses dados foram obtidas as curvas da variação de energia livre com o aum ent o da t em perat ura. Os valores de Tm ( figura 41) , correspondentes ao ponto central das curvas de desnat uração quando ∆G é igual a zero, foram calculados.
Os valores dos parâm etros term odinâm icos obtidos das curvas de van’t Hoff ( figura 42) foram considerados para o cálculo da energia livre de Gibbs a 25º C (∆G²5), que corresponde à estabilidade term odinâm ica e estrutural da proteína. Todos os parâm etros term odinâm icos estão apresentados na tabela 14.
Figura 4 1 . Variação de energia livre de Gibbs (∆G) est im ada a partir das curvas de desnat uração t érm ica das prot eínas: tripsina, quim ot ripsina, BTCI em com plexos binário com quim ot ripsina, tripsina, e com plexo ternário com am bas as enzim as, em pH 7,0.
Figura 4 2 . Gráfico de Van’t Hoff para a desnaturação térm ica da
t ripsina, da quim ot ripsina e para o BTCI em com plexos binário com quim ot ripsina, t ripsina, com plexo t ernário com am bas as enzim as, em pH 7,0.
Tabela 1 4 . Parâm etros term odinâm icos dos com plexos com o BTCI
calculados a partir das curvas de desnaturação t érm ica em t am pão 2 m M HEPES pH 7,0.
T m ? Hm ? Sm ? G2 5
( º C) ( kcal.m ol- 1) ( cal.m ol-1.K-1) ( kcal.m ol- 1) Quim otripsina 53,77 128,11± 2,79 369,69 ± 7,67 17,94 BTCI – Quim ot ripsina 62,04 166,90 ± 4,64 470,01 ± 8,73 26,83 Tripsina 70,45 60,32± 2,18 165,77± 5,93 10,92 BTCI - tripsina 71,17 80,19 ± 4,02 220,19 ± 9,59 14,57 Ternário 77,14 69,33 ± 1,73 132,55 ± 4,74 29,83
O valor de Tm encont rado para a quim ot ripsina foi de 53,77º C em pH neut ro, sem elhant e ao valor de 53,64º C encont rado por Diego et . al. , ( 2004) em água. Os v alor es de ∆H (128,11 kcal.m ol- 1) e ∆S (369,69 kcal.m ol- 1) são diferent es dos valores obt idos por Lee e Tim ashef ( 1981) para a quim ot ripsina em pH 3,0 (∆H = 90 kcal.m ol-1 e ∆S = 280 cal.m ol-1) . Sim ilarm ente, o valor estim ado nesse trabalho de ∆G de 17,94 kcal.m ol-1 em pH 7,0 (próxim o ao pH ót im o da enzim a) foi m aior do que o estim ado pelos referidos autores ( 7,96
kcal.m ol-1) em pH 3.0. I sso indica que a est rut ura t ridim ensional da quim ot ripsina é m ais est ável em pH 7,0 com parado com pH 3,0. Esses dados foram estim ados para as curvas de desnat uração t érm ica segundo o m odelo de dois est ados, com os valores da elipt icidade próxim os de zero.
Para o com plexo form ado pelo BTCI com a quim otripsina, o valor de Tm foi de 62,04 º C, m aior que o valor encont rado para a enzim a na form a livre, indicando que a associação do inibidor est abiliza a enzim a. De form a sem elhant e, o valor de ∆G25 aum entou
de 17,94 kcal.m ol- 1 para 26,83 kcal.m ol- 1, reforçando o efeito
est abilizador do inibidor na enzim a. Os parâm et ros t erm odinâm icos obt idos no present e t rabalho indicaram a alt a est abilidade t érm ica da quim ot rispina na presença do inibidor, em concordância com a m aioria das prot eínas globulares t erm ofílicas que apresent am valores de ∆G25 acim a de 10 kcal.m ol- 1 (Kum ar et al. , 2000; Kum ar et al.,
2001). Efeit os sem elhant es de est abilização da quim ot ripsina foram observados após a com plexação da enzim a com polím ero de colest erol ( Nishikawa et . al., 1994) , com preservação da est rut ura até a tem peratura de 80º C.
O processo de desnat uração t érm ica da t ripsina ocorreu de form a sem elhant e ao da quim ot ripsina, com desnat uração com plet a da enzim a at é a t em perat ura de aproxim adam ent e 80oC. O valor de
Tm encont rado em pH neut ro foi de 70,45º C próxim o ao valor de 72,3º C encont rado por Donovan e Beardslee (1974) para a β-tripsina em pH 6,7. O valor de ∆G25 calculado foi de 10,92 kcal.m ol- 1.
A form ação do com plexo do BTCI com a t ripsina alt erou em part e a est abilidade da enzim a, indicado pela variação do valor de Tm de 70,45º C para a t ripsina livre e de 71,17 º C para o com plexo. O valor est im ado para o ∆G25 foi de 14,57 kcal.m ol- 1, próxim o daquele
est im ado para a t ripsina livre ( 10,92 kcal.m ol- 1) , e, provavelm ente,
correspondeu ao estágio interm ediário desse processo de desnat uração, principalm ente da enzim a.
O processo de desnaturação do com plexo ternário não ocorreu com pletam ente, com o indicado pelos valores da elipticidade m olar ( aproxim adam ent e - 4.000 graus.cm2.dm ol- 1) at é 95oC. O valor de
Tm de 77,14 º C, m aior que os valores encontrados para os com plexos binários, e ∆G25 de 29,83 kcal.m ol-1, corresponderam
provavelm ent e à desnat uração das enzim as som ent e ou m udanças conform acionais nas prot eínas envolvidas. Na form ação do com plexo t ernário o efeit o de est abilização das enzim as foi superior ao com parado ao efeit o causado na form ação dos com plexos binários. O processo de desdobram ento de proteínas dim éricas, quando ocorre em um a única t ransição, result a em valores de ∆G25 no int ervalo de
10-27 kcal.m ol-1, que é significat ivam ent e m aior do que a estabilidade
conform acional encont rada para prot eínas m onom éricas ( 5-15
kcal.m ol-1; Neet e Tim m , 1994; Pace et . al, 1997). O valor encontrado
para o com plexo ternário do BTCI está acim a deste intervalo, confirm ando a estabilidade do com plexo, m esm o considerando o processo de desdobram ento das proteínas de m ais de dois estados.
A m agnitude da estabilidade conform acional está relacionada com o t am anho da prot eína, do núm ero de subunidades e é dependent e do t ipo de int eração na int erface da est rutura de com plexos ou est rut uras oligom éricas ( Neet e Tim m , 1994) . O com plexo t ernário é result ant e da int eração ent re as enzim as t ripsina e quim ot ripsina com o BTCI e apresent a as duas int erfaces dist int as de int eração. Os parâm et ros t erm odinâm icos est imados para os com plexos binário e o t ernário, m ost raram que as int erações iônicas presentes na interface da tripsina apresentam um efeito de estabilização m ais pronunciado que as interações hidrofóbicas presentes na interface da quim otripsina.
A associação do BTCI com a t ripsina é diferent e da associação com a quim otripsina. A constante de associação da quim otripsina com o BTCI est á em t orno de 0,32 a 1,36x107 M- 1 ( Freit as et. al, 1999) - dependent es da t em perat ura, enquant o que para a t ripsina na m esm a faixa de t em perat ura e pH os valores variam de 1,5 a
3,4x108 M- 1 ( Fachet t i et . al., 1984). No BTCI o sítio antitrítptico
apresenta predom inância de contatos hidrofílicos, com a presença de várias ligações de hidrogênio e m enor rigidez conform acional. Em cont rast e, o sít io reat ivo para a quim ot ripsina há predom inância de contatos hidrofóbicos e m aior flexibilidade conform acional. Essas diferenças estruturais são determ inantes para a m aior afinidade do BTCI para a tripsina e, provavelm ente para as diferenças na estabilidade estrutural dos com plexos binários e do ternário form ados pelo BTCI com as respect ivas enzim as.
I nibidores da fam ília BBI são conhecidos por sua est abilidade a alt as t em perat uras conferidas pela presença de ligações dissulfet o. Apesar disso, poucos dados quantitativos que caracterizam essa est abilidade são encont rados na lit erat ura, excet uando um único art igo ( Donovan e Beardslee, 1974) que discut e a est abilidade térm ica de com plexo de inibidores com suas enzim as alvo, apenas com os valores da tem perat ura de t ransição ent re o est ado nat ivo e desnat urado, com o foi com parado com os dados aqui apresent ados e discut idos acim a.
Experim ent os realizados com o inibidor Bowm an-Birk WSTI , m ostraram que o inibidor m anteve atividade m esm o após perm anecer por um a hora a 90º C ( Deshim aru et. al. , 2002). De form a sem elhant e, o inibidor BBI m ant eve m ais de 60% da at ividade anti-tríptica após 3 horas de exposição a 100º C, em pH neutro ( Osm an et . al., 2002) . Sim ilarm ente, o BTCI apresenta estabilidade conform acional, m antendo sua atividade inibitória m esm o após a exposição a t em perat uras de 95º C durant e um a hora ( Silva et . al. , 2001) . Ensaios de desnaturação térm ica utilizando o CD e m icrocalorim et ria de varredura ( DSC) indicaram que est a m olécula não desnat ura, m esm o em tem peraturas elevadas atingidas no
m icrocalorím et ro ( dados não m ost rados) . Est a est abilidade é devida em grande parte a presença das sete ligações dissulfeto no BTCI .
Devido à estabilidade atribuída às ligações dissulfeto dos inibidores da fam ília Bowm an-Birk, as m edidas de parâm et ros que caracterizam a estabilidade térm ica da proteína são difíceis de serem obt idas, sendo necessária a realização de experim ent os em condições que possibilit em a redução dessas ligações. Experim ent os de desnaturação térm ica com o feij ão t epari (Phaseolus acut ifolius) só foram possíveis com as ligações dissulfet o reduzidas (Osm an et. al., 2002) . I nibidores da fam ília Kunit z – tipo STI , que apresentam som ente duas ligações dissulfeto, desnaturam na faixa que varia de 60 a 70º C ( Baugh e Trowbridge, 1972; Fan et . al., 2007; Pouvreau et . al., 2005; Roychaudhuri et . al. , 2003; Yoshizaki et . al. , 2007) . Esses dados são com paráveis aos ensaios de desnaturação térm ica dos com plexos binários e ternário do BTCI .
Com o indicado pela figura 39, o processo de desnaturação das prot eínas na form a livre ocorreu em dois est ados, m as foi incom plet o para os com plexos BTCI -tripsina e o ternário. Esse resultado ocorreu devido principalm ente à taxa lenta de dissociação do BTCI dos com plexos; a perm anência do BTCI no sitio ativo da enzim a, m esm o após ação catalítica; e a estabilidade do BTCI devido à presença de sete ligações dissulfeto. Esses dados m ostram que a associação do BTCI com as enzim as aum enta a estabilidade dessas proteínas nos com plexos.
O processo de desnaturação de proteínas oligom éricas ou em com plexos m acrom oleculares tende a ocorrer de diferentes form as: a) as prot eínas podem se dissociar e ent ão desnat urar; b) podem sofrer desnaturação enquanto com plexadas, e posteriorm ente se dissociarem ; c) ou um a das proteínas – a m enos est ável - pode se desnat urar em com plexo, se dissociar, e depois a prot eína m ais
estável sofre desnaturação ( Donovan e Beardslee, 1974; Neet e Tim m , 1994) . Muit as prot eínas m onom éricas e dim éricas desnat uram de acordo com o m odelo de dois estados (Pace et. al, 1997), enquant o out ros apresent am int erm ediários est áveis no processo. Em proteínas oligom éricas, o processo de desnaturação pode ocorrer em vários estados, sendo que o prim eiro corresponde, geralm ente, à dissociação das subunidades, m ant endo a est rut ura dos m onôm eros. Posteriorm ente, ocorre a desnaturação com o desdobram ento de t odas as cadeias que form am o oligôm ero ( Kirschner e Tanford, 1964; Neet e Tim m , 1994) .
Segundo Donovan e Beardslee ( 1974) a determ inação do m odelo que m elhor descreve o processo de desnat uração de com plexos form ados com inibidores de proteases, principalm ente os m em bros da fam ília Bowm an-Birk, é de difícil escolha. I sso é j ust ificado pelo fat o de que o processo de dissociação do inibi dor com a enzim a é lent o ou nem ocorre devido à rest rição conform acional definida por um a ligação dissulfeto no sitio reativo. Além disso, a presença das set e ligações dissulfet o no inibidor rest ringe a liberdade conform acional da m olécula e dificult a o processo de desdobram ento da est rut ura t ridim ensional. No ent ant o, para os inibidores do t ipo Kunitz, que apresentam m enor núm ero de ligações dissulfeto, os com plexos podem ser desnat urados seguindo m odelos de dois ou m ais est ados. Para o com plexo STI -t ripsina, um exem plo de inibidor do t ipo Kunit z, o m odelo m ais adequado foi aquele de dois est ados com a desnat uração do com plexo sem a form ação de int erm ediários ( Donovan e Berdslee, 1974) .
O dicroísm o circular, na faixa de com prim ento de onda est udada, perm it e acom panhar m udanças conform acionais no nível das est rut uras secundárias de prot eínas. No ent ant o, o desaparecim ento das bandas dicróicas com a dim inuição da
elipiticidade para próxim o de zero, dependentes da tem peratura, indica que a prot eína desnat ura nessas condições. Nesse t rabalho, as curvas de desnaturação térm ica m ostram que o sinal dicróico perm aneceu abaixo de -1500 graus.cm2.dm ol- 1 para as enzim as
livres, -2500 graus.cm2.dm ol- 1 para o com plexo BTCI -quim otripsina e
aproxim adam ent e -4000 graus.cm2.dm ol- 1 no final da transição (95oC) para o com plexo BTCI -Tripsina e o com plexo t ernário. Esses
últim os dados indicam que parte da estrutura desses dois com plexos pode estar preservada, provavelm ente devido a estrutura rígida do BTCI definida pelas set e ligações dissulfet o. Para o com plexo BTCI - quim ot ripsina, a desnat uração t am bém não foi t ot al. No ent ant o, diferent e do com plexo binário com a t ripsina, essa m olécula apresent ou int erm ediários m uit o m ais m odificados est rut uralm ent e, decorrentes da ruptura de m aior núm ero de interações que m antêm a est rut ura t ridim ensional das prot eínas, o que est á indicado pelos valores da ent alpia e ent ropia apresent ados na t abela 14. Para analisar o processo de desdobram ent o dessas m oléculas out ros experim entos que associem outros agentes desnaturantes com a tem peratura e outras técnicas, com o a m icrocalorim etria, desnat uração dos com plexos com as ligações dissulfet o parcialm ent e ou totalm ente reduzidas, precisam ser realizados.
Para aplicações biot ecnológicas de enzim as e inibidores é fundam ental que os com plexos entre essas proteínas perm aneçam estáveis e associadas, garantindo o efeito prolongado da inibição das enzim as alvo. Algum as dessas ações, no caso dos inibidores da fam ília a qual pert ence o BTCI , podem ser a aplicação terapêutica cont ra diversas doenças com o a esclerose m últ ipla; a ação anticarcinogênica e a utilização de inibidores no controle biológico de pragas.
7 CON CLUSÃO
• A est rut ura t ridim ensional crist alográfica do BTCI foi resolvida em com plexo binário com a tripsina. Esta estrutura é a de m aior resolução dest a fam ília j á deposit ado no PDB.
• A est rut ura t ridim ensional crist alográfica do BTCI foi resolvida em com plexo ternário com a tripsina e a quim otripsina. Esta é a única est rut ura de um inibidor Bowm an-Birk associados a quim ot ripsina e t ripsina sim ult aneam ent e e será a prim eira est rut ura dessa fam ília de inibidores em com plexo com a quim ot ripsina a ser deposit ada no PDB.
• A estrutura tridim ensional cristalográfica do BTCI em com plexo t ernário foi resolvida em pH neut ro e ácido, e m ost rou que não há diferenças significat ivas na est rut ura t ridim ensional dependes desses pHs.
• Ocorrem poucas m odificações na estrutura tridim ensional durant e a form ação dos com plexos, sendo a m aioria delas localizadas nas enzim as e na int erface ent re as prot eínas.
• As alterações conform acionais do com plexo binário do BTCI com a t ripsina ocorrem principalm ent e na região da int erface ent re as duas prot eínas, indicadas pela m odificação do am bient e dos triptofanos nessa região.
• Alt erações conform acionais na interface do com plexo binário ent re o BTCI e a quim ot ripsina não foram evident es, indicadas pela preservação da acessibilidade dos t ript ofanos ao solvent e.
• O BTCI não apresentou diferenças conform acionais nos diferent es pHs.
• O processo de desnaturação dos com plexos form ados pelo BTCI e as enzim as não seguem o m odelo de dois est ados, sendo o um dos estágios do desdobram ento correspondente ao desdobram ento inicial das enzim as, com preservação do BTCI associado às m esm as.
• A form ação dos com plexos binários e o ternário prom overam estabilização das proteínas, indicadas pelo aum ento das tem peraturas de t ransição durant e o desdobram ent o das prot eínas e pelos alt os valores de ∆G25 estim ados para os com plexos com parados às
8 REFERÊN CI AS BI BLI OGRÁFI CAS
Alcala, J. R.; Grat t on, E.; Prendergast , F. G.. Resolvabilit y of
fluorescence lifet im e dist ribut ions using phase fluorom et ry.
Biophysical Journal 1987, 51 ( 4) , 587-596.
Alvizo, O.; Allen, B.D.; Mayo, S.L.. Com put at ional prot ein de sign
prom ises t o revolut ionize prot ein engineering. Biot echniques
2007 Jan; 42(1): 31, 33, 35
Aragao, J. B.; Vent ura, M. M.. An infrared spect roscopic st udy on
t he secondary st ruct ure of t he black- eyed pea t rypsin and chym ot rypsin inhibit or - am ide - i- iii and am ide - v bands. Anais
Da Academ ia Brasileira De Ciencias 1986, 58 ( 3) , 339-343.
Ascenzi, P.; Bocedi, A.; Bolognesi, M.; Spallarossa, A.; Colet t a, M.; De Crist ofaro, R.; Menegat t i, E.. The bovine basic pancreat ic
t rypsin inhibit or ( Kunit z inhibit or: A m ilest one prot ein. Current
Protein & Peptide Science 2003, 4 (3), 231-251.
Baek, J. M.; Song, J. C.; Choi, Y. D.; Kim , S. I .. Nucleotide -
sequence hom ology of cdnas encoding soybean bow m an- birk t ype prot einase - inhibitor and its isoinhibitors. Bioscience
Biot echnology and Biochem istry 1994, 58 (5), 843 -846.
Barbosa, J.; Silva, L. P.; Teles, R. C. L.; Esteves, G. F.; Azevedo, R. B.; Ventura, M. M.; de Freitas, S. M.. Cryst al st ruct ure of t he
Bow m a n- Birk inhibit or from Vigna unguiculat a seeds in com plex w ith beta - t rypsin at 1 .5 5 angst rom resoulut ion and its structural properties in associtation w ith proteinases.
Biophysical Journal 2007, 92 ( 5) , 1638-1650.
Barret t , A.J.; Rawlings, N.D.. Evolut ionary lines of cyst eine
pept idases. Biol Chem . 2001 May; 382( 5) : 727-33.
Baugh, R.J.; Trowbridge, C.G.. Calorim et ry of som e t rypsin-
t rypsin inhibit or react ions. J Biol Chem . 1972 Dec
10; 247(23): 7498-501.
Beechem , J.M.; Brand, L.. Tim e- resolved fluorescence of
Biet h, J.G.. Theoret ical and pract ical aspect s of prot einase
inhibit ion kinet ics. Prot eolyt ic Enzym es: Aspart ic and Met allo
Peptidases, 1995; Vol. 248, pp 59-84.
Birk, Y.. The bow m a n- birk inhibitor - t rypsin- inhibit or and
chym otrypsin - inhibit or from soybeans. I nt ernat ional Journal of
Peptide and Protein Research 1985, 25 (2), 113-131.
Birk, Y.; Gertler, A.; Khalef, S.. A pure t rypsin inhibit or from soya
beans. Biochem ical Journal 1963, 87 (2), 281-&.
Birk, Y.; Gert ler, A.; Khalef, S.. Furt her evidence for a dual
independent act ivit y against t rypsin and alpha - chym ot rypsin of inhibit or aa from soybenas. Biochim ica Et Biophysica Act a
1967, 147 (2), 402-410.
Bode, W.; Huber, R.. Natural protein proteinase - inhibitors and
t heir int eract ion w it h prot einases. European Journal of
Biochem ist ry, 1992, 204 (2), 433-451.
Bode, W.; Huber, R.. Proteinase - protein inhibitor interaction. Biom ed Biochim Acta. 1991; 50( 4-6) : 437-46.
Bowm an, D. E.. Different iat ion of soy bean ant it ryot ic fact ors. Proceedings of the Society for Experim ental Biology and Medicine