infantum
3.11.1 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico
Inicialmente, as seringas heparinizadas contendo sangue destinado aos ensaios de
cultivo celular, foram descontaminadas com álcool 70% (Veco®, Brasil) para início do
processamento do material. Logo em seguida, os 40 mL de sangue coletados foram aplicados lentamente sobre um gradiente de Ficoll-Hypaque constituído por 15mL de Ficoll-hypaque
1.119 e 15 mL de Ficoll-hypaque 1.077 (Histopaque® - Sigma Co., EUA) em dois tubos de 50
mL de polipropileno (Falcon®, Becton Dickison and Company, EUA), os quais foram
centrifugados a 450 x g por 70 minutos a 4oC. Após este procedimento, o anel celular contendo
as células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foi recolhido com auxílio de pipeta Pasteur autoclavada e transferido para outro tubo de 50 mL de polipropileno. À suspensão de
SSC -He ig h t FSC-Height FL1-H::GFP SSC -He igh t FL1-H::GFP
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CMSP foi adicionado 30mL de PBS + EDTA (2mM), seguido de centrifugação a 400 x g por 10 minutos a 4ºC. Este processo foi repetido, sendo realizada finalmente uma última lavagem com RPMI 1640 (10% SFB), a 400 x g por 10 minutos a 4ºC. Ao final, as células foram ressuspensas em 2 mL de RPMI 1640 (10% SFB).
Para contagem celular, foi utilizada a câmara de Neubauer (Boeco, Germany). Desta forma, foram utilizados 10 μL da suspensão celular diluídos em 190 μL de solução de Azul de Trypan (Sigma Co., EUA) (diluição 1:20). O valor obtido foi multiplicado pelo volume
ressuspendido e o fator de diluição. Assim, o volume final foi ajustado para conter 1x106
células/mL.
Além disso, separou-se uma alíquota de 50µl de cada amostra para obtenção da
percentagem de monócitos por citometria de fluxo (FACScalibur - Becton Dickinson®,
Mountain View, CA, USA). As CMSP foram então transferidas para garrafas de cultura de400
mL (Nunc®, Thermo Fisher, Denmark) que permaneceram incubadas durante 24h em estufa
com 5% CO2 a 37ºC. Finda a incubação, os monócitos encontravam-se aderidos ao fundo da
garrafa e os linfócitos permaneceram no sobrenadante. Sendo assim, o meio de cultura contendo os linfócitos foi transferido para outra garrafa de cultura, separando os dois tipos de CMSP. 3.11.2 Condições de cultivo para derivação de monócitos circulantes em macrófagos
Após separação dos linfócitos presentes no sobrenadante, foi adicionada à garrafa contendo os monócitos, a mesma quantidade de RPMI (10% SFB) suplementado com 20% de sobrenadante de fibroblastos da linhagem L929 contendo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). Ambas as garrafas de cultura foram incubadas por mais 4 dias, nas mesmas condições anteriores. Todo esse procedimento foi realizado de acordo com VIANA et al. (2013, 2015, 2016). Após os 5 dias de cultivo, o sobrenadante das garrafas de cultura contendo os macrófagos foi descartado, sendo a garrafa completa com 50mL de RPMI 1640 (10% SFB) gelado. Posteriormente, as células foram raspadas levemente com a ajuda de um
cell scraper (SPL Life Sciences Co., Ltd®) e o sobrenadante transferido para um tubo de
polipropileno de 50 mL. Após o processo de centrifugação a 450 x g, 10 minutos, 4oC, o pellet
foi ressuspendido em 2 mL de RPMI (10% SFB). Uma alíquota foi separada para contagem
das células na câmara de Neubauer e posteriormente foi realizado o ajuste para 1x106
macrófagos/mL.
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3.11.3 Purificação de linfócitos T CD4+ e T CD8+
Após 5 dias de cultivo, as células linfocitárias foram coletadas e transferidas para tubos
de 50 mL de polipropileno (Falcon®, Becton Dickison and Company, EUA), que foram
centrifugados a 400 x g, 10 minutos, 4oC. O sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido em 6 mL de RPMI 1640 (10% SFB), colocado sobre 4,5 mL de Ficoll-hypaque
1.119 e 4,5 mL de Ficoll-hypaque 1.077, seguido de centrifugação a 450 x g, 70 minutos, 4oC,
de forma a separar os linfócitos num anel celular distinto. Seguidamente, o anel foi recolhido para um tubo de polipropileno de 15mL, completado com RPMI 1640 (10% SFB),
centrifugado a 400 x g, 10 minutos a 4oC e ressuspendido em 1 mL de RPMI 1640 (10% SFB),
para contagem na câmara de Neubauer e posterior marcação com 8L de anticorpo anti- CD8FITC, seguida de incubação ao abrigo da luz por 20 minutos. Após a incubação, foram adicionados 10 mL de PBS-W + EDTA (0.5% albumina sérica bovina + 2mM EDTA), seguido
de centrifugação a 400 x g, 10 minutos, 4oC e ressuspenção em PBS-W + EDTA na proporção
de 90ul por cada 1x107 células. Posteriormente, 10L das beads anti-FITC (BD-Biosciences®)
foram adicionadas, com incubação por 20 minutos, centrifugação a 400 x g, 10 minutos, 4oC
e ressuspensão em 500 L de PBS-W + EDTA.
Em seguida, a suspensão celular foi adicionada à coluna de MACS (Miltenyi Biotec®).
Após todo o líquido ser absorvido pela coluna, foram adicionados à mesma 15 mL de PBS-W + EDTA, deixando gotejar todo o volume para um tubo de polipropileno de 50 mL (Depletado
1). De forma a liberar os linfócitos T CD8+ retidos, a coluna foi retirada do suporte e lavada 3
vezes com 5 mL de solução tampão (PBS-W + EDTA), pressionando vigorosamente o êmbolo,
sendo os linfócitos T CD8+ transferidos para um tubo de polipropileno de 50mL. Este tubo foi
centrifugado a 400 x g, 10 minutos, 4oC, o sobrenadante descartado, ressuspendido em 1mL,
e uma alíquota foi retirada para avaliação da pureza desta subpopulação por citometria de fluxo. Finalmente, foi efetuada a contagem em câmara de Neubauer, de forma a ressuspender
os linfócitos T CD8+ na concentração de 2x105/mL.
O tubo contendo a suspensão celular após depleção dos linfócitos T CD8+ (depletado
1), foi centrifugado 400 x g, por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado 8 L de anti-CD4FITC, seguido de incubação ao abrigo da luz durante 20 minutos. Em seguida, foram adicionados à suspenção celular 10 mL de PBS-W + EDTA, seguido de
centrifugação a 400 x g, 10 minutos, 4oC e ressuspenção em PBS-W + EDTA na proporção de
90ul por cada 1x107 células. Posteriormente, 10L das beads anti-FITC foram adicionadas,
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L de PBS-W + EDTA. Tal como descrito no processo de isolamento de linfócitos T CD8+, a
suspensão celular foi adicionada à coluna de MACS, seguida de 15 mL de PBS-W + EDTA e
após passagem de todo o líquido pela coluna, os linfócitos T CD4+ foram libertados e lavados
3 vezes com 15 mL solução tampão, pressionando de forma vigorosa o êmbolo. Este tubo foi
centrifugado a 515 x G, 10 minutos, 4oC, o sobrenadante descartado e ressuspendido em 1mL
para contagem dos linfócitos T CD4+, ajustando-se para a concentração de 2x105/mL. Uma
alíquota foi retirada para aferição da pureza dos linfócitos T CD4+ por citometria de fluxo.
A figura 3 representa os gráficos demonstrativos da pureza do isolamento de linfócitos
T CD4+ e linfócitos T CD8+. As figuras da esquerda representam gráficos de densidade,
coloridos artificialmente segundo o número de células em cada ponto, em função da granulosidade (SSC – side light scatter) versus fluorescência 4 (FL-4) (Figura 3A), ou fluorescência 1 (FL-1) (Figura 3C) da população de linfócitos, de forma a estabelecer o limite de auto-fluorescência das células não marcadas. As figuras 2B e 2D representam gráficos de
densidade SSC versus FL-4 (anti-CD4+APC) e FL-1 (anti-CD8+FITC), respetivamente.
Utilizando a fronteira estabelecida anteriormente é possível observar no quadrante 3 (Q3) de ambos os gráficos, que foram conseguidos graus de pureza superiores a 90%, tanto em
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Figura 3: Percentual de pureza de linfócitos T CD4+ e T CD8+ a partir do sangue periférico de cães naturalmente
infectados e hígidos, mantidos em cultura por cinco dias e submetidos à purificação com microbeads e colunas magnéticas. (A e C) Gráficos de densidade SSC vs (A) FL-4 ou (C) FL-1 utilizados para estabelecer o limite de auto-fluorescência da população negativa. (B e D) Gráfico de densidade de SSC vs (B) CD4+ - APC/FL-4 ou (D)
CD8+ - FITC/FL1, empregado para quantificar o percentual de linfócitos T purificados. No quadrante 7 (Q7) da
figura B e quadrante 3 (Q3) da figura D estão indicados, respetivamente, os percentuais (%) de pureza das subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+.
3.11.4 Co-Cultivo celular
Além dos linfócitos e macrófagos foi necessário preparar as promastigotas de L.
infantum OP46 GFP para o co-cultivo. Para isto, 2 mL da cultura de promastigotas de L. infantum, em fase estacionária de crescimento, cultivadas em meio NNN/LIT foram
transferidas para um tubo falcon de 15mL, ao qual foram adicionados 8 mL de RPMI (10%
SFB). O tubo foi centrifugado por 550 x g, 10 minutos, 24oC, o sobrenadante foi descartado,
as promastigotas ressuspendidas em 1 mL de RPMI com 10%SFB e contadas em câmara de
Neubauer. A seguir, foi ajustada a concentração de promastigotas para 1x107 parasitos/mL.
No final de todo o processo descrito até aqui (obtenção dos macrófagos, separação das subpopulações de linfócitos em colunas magnéticas e crescimento de promastigotas de L.
infantum OP46 GFP), 1x105 macrófagos foram transferidos para cada um dos tubos de
FL4-H ::CD4 APC