5. Methodology
5.1.3 TREND function in Excel
Os compostos eluídos são transportados pela fase móvel até o detector e registrados em curvas gaussianas (formato de um sino). Estes sinais são conhecidos como picos (Figura 8) e a representação gráfica dos picos (do sinal analíico) em função do tempo ou do volume de fase móvel é conhecido como cromatograma.
Figura 9. Forma do pico. Fonte: MEYER, 2004.
O pico fornece informações qualitativas e quantitativas da mistura em questão:
(a) Qualitativa: O tempo de retenção de um componente é sempre constante sob condições idênticas cromatográficas. O tempo de retenção é o período compreendido entre a injeção da amostra e o ponto máximo (ápex) do pico cromatográfico referente àquela substância. As dimensões da coluna, tipo de fase estacionária, composição de fase móvel, velocidade de fluxo, tamanho da amostra e temperatura influenciam de forma única a retenção de dado analito. Por isso, um pico pode ser identificado ao injetar a amostra e um padrão de referência autêntico da substância em questão.
(b) Quantitativo: Tanto a área quanto a altura do pico podem ser proporcionais à quantidade do composto injetado. Um gráfico de calibração pode ser derivado das áreas dos picos ou alturas obtidas para várias soluções de amostras com concentrações conhecidas, e uma comparação de tamanho de picos pode ser usada para determinar a concentração de uma amostra desconhecida.
O cromatograma pode ser usado para prover informação de eficiência de separação (Figura 9). Aqui w é a largura do pico na linha de base, t0 é o tempo morto ou tempo de
retenção de um soluto não retido, (o tempo requerido para a fase móvel atravessar a coluna). Assim, a velocidade linear do fluxo, u, pode ser calculada:
Figura 10. Cromatograma e suas principais características. Fonte: MEYER, 2004.
A coluna cromatográfica pode ser imaginada como composta de várias divisões chamadas de “pratos teóricos”. O soluto ao mover-se por estas divisões realiza sucessivos equilíbrios entra a fase estacionária e a fase móvel. Assim, quanto maior o número de pratos teóricos de uma coluna maior será sua eficiência (MEYER, 2004).
O número de pratos teóricos “n” ou “N” de uma coluna se define por:
n = (t
r/σ)²
(2)Onde “tr” é o tempo de retenção do soluto e “σ” é o desvio padrão do mesmo pico
(parâmetro difícil de ser medido). Vários métodos baseados em aproximações e extrapolações das partícularidades de um pico gaussiano são disponíveis, permitindo-nos calcular “N” da seguinte forma:
N = 16 (t
R/w)² ou N = 5.54 (t
R/W
1/2)²
(3)
Onde “W” é a largura do pico na linha de base e W1/2 é a largura do pico a meia altura.
Assim, “N” (numero de pratos teóricos) é um parâmetro adimensional, em decorrência das duas variáveis tempo de retenção e largura de pico serem medidas em unidades de tempo. Pode-se ainda calcular “n” com as seguintes equações:
n = 16 (t
r/Wb)² ou ainda n=5.54 (t
r/W
h/2)²
(4)Com picos com tempo de retenção pequenos o volume morto da coluna colabora de uma forma significativa para a retenção total de um soluto. Assim, tendo em vista este fato outra equação pode ser usada para obter um parâmetro denominado número de pratos teóricos efetivos (N, efective plate number):
N=16 [(t
r-tm)/Wb]² ou N=5.54 [(t
r-tm)/W
h/2]²
(5)Assim, de forma prática devemos manter o fator de retenção de cada componente de uma mistura em uma separação por métodos cromatográficos entre os valores de 5 e 10 (no maximo15). Picos com valores de fatores de retenção pequenos eluem muito próximo ao volume morto e podem coeluir com impurezas da amostra. Fatores de retenção com valores elevados, acima de 15 fazem com que os tempos de análise sejam muito longos, eliminando qualquer ganho de pratos teóricos efetivos (N) pelo alargamento da banda cromatográfica. Para picos assimétricos, que fogem do padrão ideal do pico gaussiano, usa-se aproximações levando em conta o grau de assimetria como a equação a seguir:
N = 41.7 (t
r/W
0.1)²/As+1.25
(6)Onde As é um fator de assimetria para o pico de interesse e W0.1 é a largura do pico a
10% da altura.
Tanto o número de pratos teóricos (n) quanto o número de pratos teóricos efetivos (N) dependem do comprimento de coluna. Para facilitar a comparação da eficiência de colunas um parâmetro foi determinado de altura equivalente a um prato teórico (h) definido como
h=L/n
(7)ou analogamente com o número de pratos teóricos efetivos:
H=L/N
(8)Mais um dado importante é a resolução do cromatograma (Rs), que é o principal parâmetro usado para descrever o grau de separação de picos adjacentes, sendo que valores acima de 1.2 são considerados adequados para picos bem resolvidos.
Estes valores são determinados pela seguinte equação:
Rs = (tr
b-tr
a) / ½. (Wa+Wb)
(9)Onde são usados tempos de retenção e largura de dois picos adjacentes.
O cálculo de pratos teóricos não pode ser realizado através de uma única corrida por método de gradiente. Resultados de pelo menos duas corridas (para gradientes lineares) com diferentes tempos de gradiente são requeridos, e até então a computação destes dados está longe de ser simples. Em muitos casos, é seguro assumir que o número de pratos teóricos de uma corrida em modo isócratico para uma dada coluna pode ser aplicado para uma separação
por método em modo de gradiente.
(http://www.lcresources.com/wiki/index.php?title=ChromFAQ:TheoreticalPlates).
A utilização de programas de computadores para facilitar o desenvolvimento de método em CLAE tem recebido atenção desde os anos setenta (SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997). Inúmeros trabalhos têm sido publicados até hoje. Os softwares para desenvolvimento de métodos comercialmente disponíveis, podem ser classificados de acordo com sua capacidade ou função.
O sistema ideal de otimização cromatográfica deve permitir ao cromatografista atingir a máxima separação de todos os componentes de uma mistura complexa de solutos dentro de um tempo de análise que seja o menor possível (D'AGOSTINO, 1985). A Tabela 2 mostra alguns métodos de otimização de fase móvel que foram desenvolvidos na década de 1980.
Quadro 2. Métodos de microcomputadores ou otimização de fase móvel de CLAE ajudada por microprocessadores.
Método Sistema Tipo Autores
COF Off-line Isocrático Glajch et al (1980)
Window Diagram Off-line Isocrático Sachok e al (1980) ORM (SENTINEL) Integral Isocrático Glajch et al (1982)
ISOORPT Integral Isocrático Berridge (1982)
TERNOPT Integral Isocrático Berridge (1982)
GRADOPT Integral Gradiente Berridge (1982)
Search and Stop Off-line Isocrático Drouen et al (1982) OPTIM (I) Integral Isocrático Bradley and Gillen (1983) OPTIM (G) Integral Gradiente Bradley and Gillen (1984)
OPEX Off-line Gradiente Sabate et al (1983)
IMGE Off-line Gradiente Kirkland and Glajch (1983) SMGE Off-line Gradiente Kirkland and Glajch (1983)
PEAKIN/SAS Off-line Isocrático Issaq (1984)
RPS Off-line Isocrático Jinno and Kawasaki (1984) CCSM-I Off-line Isocrático D’agostino et al. (1984) Fonte: D'AGOSTINO, 1985.
Otimizar parâmetros envolvidos nos métodos de desenvolvimento de separações cromatográficas na década de 80 só era possível com a ajuda de computadores e microprocessadores. Mesmo com o auxílio destas ferramentas o procedimento requeria várias corridas experimentais (que aumentavam em número a medida que novas variáveis eram adicionadas aos cálculos). Os processadores do período gastavam muito tempo em computação das predições (4 a 6 horas), mesmo sendo otimizações de problemas cromatográficos simples. Os programas citados acima na tabela, eram comercialmente disponíveis na época e são revisados com certa minúcia na literatura especializada (D'AGOSTINO, 1985).
Os programas utilizavam abordagens matemáticas, alguns explorando desenho fatorial para pesquisar e avaliar determinados critérios nos cromatogramas analisados e a partir destes otimizá-los (COTTON, 1983). São os que se seguem: Função de resposta cromatográfica (chromatographic response function – CRF) Kaiser (KAISER, 1960); Produto de resolução relativa (Relative resolution product – RRP) Schoenmakers (SCHOENMAKERS et al, 1982); função cromatografica de otimização (Cromatographic optimization function – COF (GLAJCH, 1980); Coeficiente de Otimização cromatográfica (Chromatographic optimization coefficient –COC) (D'AGOSTINO, 1985).
Cada programa citado na lista auxiliava em um aspecto de desenvolvimento de CLAE, sendo necessário o uso de dois ou mais programas para cobrir as variadas possibilidades de exames como os modos de análise isocrático, uso de fases ternárias ou quaternárias, modo gradiente, modo gradiente não linear com/ ou sem passos isocráticos.
Na década seguinte o mercado já possuía novos e mais eficazes softwares de predição, tanto em conseqüência da presença de máquinas com processadores mais potentes e velozes quanto pelo maior conhecimento obtido em modelos matemáticos para predição do comportamento cromatográfico em função das mudanças das variáveis de separação.
Destes podemos destacar o software Drylab (SNYDER, 1989; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997) que possui ampla literatura especializada relacionada ao seu desempenho, bem como outros disponíveis no mercado e citados em quadro abaixo, com suas respectivas finalidades descritas (SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH , 1997).
Quadro 3. Classificação de softwares comerciais de desenvolvimento de método de acordo com sua capacidade.
1- Mudança de uma variável de retenção por vez, predizendo a separação como função desta variável. (Drylab b***)
2- Mudança de uma ou mais variáveis por vez predizendo separação como função dessas variáveis. (ICOS c**, DIAMOND d**)
3- Mudança de condições de coluna (Dimensões da coluna, tamanho da partícula, fluxo,) predizer separação para qualquer condições da coluna. (Drylab b***, ENHANCER d**)
4- Mudanças de condições de gradiente, predizer separações para quaisquer condições de gradiente. (Drylab b***)
5- Mudança de uma ou mais condições, examinar cromatogramas experimentais pela melhor separação (Pesos e***)
6- Experts systems. Sistemas especializados para predizer as melhores iniciais de separação sobre a base de amostra de compostos moleculares estruturais (?) (ELUEX f*, CHROMDREAM g*, HPLC-METABOLEXPERT f*, ProDigest-LC h*)
7- Sistemas especializados para aconselhar em outros aspectos de desenvolvimento de método de HPLC.
a) Exemplos de cada programa de computador é dado entre parênteses. Estes programas eram avaliados comercialmente em 1996. * software Stand-alone; ** Software integrado a sistemas; *** Encontrando tanto no formato stand-alone quanto integrado a sistemas. b) LC Resources, Walnut Creek, CA. (Mudança de duas variaveis possiveis com DryLab 2.0 introduzida em 1997)
c) Hewlett-Packard, Wilmington, DE. d) ATI, Cambridge, UK (antiga Philips) e) Perkin-Elmer Corp., Nowwalk, CT. f) CompuDrug, Budapest, Hungary. g) H. Knauer GmbH, Berlin, Germany. h) Synthetic Peptides, Alberta, Canada.
Os métodos aplicados cobrem tanto situações estáticas quanto dinâmicas. Em todos os casos o tempo de computação aumenta rapidamente de acordo com o tamanho do sistema a ser estudado. O sistema pode ser uma simples molécula, um grupo de moléculas relacionadas ou um grupo de moléculas estruturalmente não relacionadas. Em geral, os métodos são baseados em teorias que fornecem previsões muito acuradas, mas aplicáveis apenas a sistemas menores, ou aquelas que fornecem previsões aproximadas para sistemas maiores. Os métodos acurados são denominados métodos ab initio, já que são baseados inteiramente na teoria desde os primeiros cálculos. Os métodos menos acurados são denominados empíricos ou semi empíricos devido ao uso de resultados experimentais juntamente com a teoria, frequentemente obtidos a partir de moléculas relacionadas. (LIPKOWITZ, 2007). Os métodos semi-empíricos demonstram predições mais confiáveis e robustas, frente aos variados problemas cromatográficos em rotinas laboratoriais (SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997; DOLAN, 1992).
Muitas das regras e relações em que se baseiam os métodos semi-empíricos são quantitativas, e então se torna necessário o uso de cálculos precisos para obter as melhores predições para a próxima análise.
Um exemplo é a retenção como função de %B em HPLC de fase reversa, que é descrita pela equação:
log K = log Kw – S Φ
(10)A %B também pode ser descrita como equivalente a 100 Φ, onde Φ é a fração do volume de solvente orgânico na fase móvel. Os valores de Kw e S são constantes para um determinado analito e condições de separação específicas. Se dois experimentos são realizados em que apenas a %B varia, é possível determinar os valores de Kw e S para cada componente da amostra, e então utilizar a relação acima para calcular a retenção dos componentes da amostra para qualquer valor de Φ (%B). Uma conseqüência desta equação é que K aumenta
por um fator de 2 a 3 para um decréscimo de 10%B, como ilustrado na Figura 10 para os compostos de A a D. Exemplificando, o valor de k para o composto D aumenta de 9 para 23 quando a fase móvel é mudada de 40 para 30%. Este fenômeno, que se aplica a muitas
substâncias que são separadas em fase reversa é conhecido como a “regra do 3”. Estes resultados podem ser demonstrados em qualquer formato tais como tabelas, gráficos, cromatogramas, cada um destes pode ajudar o cromatografista a selecionar mais rapidamente as melhores condições para uma dada amostra. A habilidade de predizer uma separação iniciando apenas com um número limitado de experimentos “reais” se torna especialmente útil em desenvolvimentos de métodos, se um grande número de corridas (>10) for necessário. Geralmente este tipo de análise é realizada em amostras contendo meia dúzia de compostos quimicamente similares e/ou separações que envolvam eluição por gradiente ou requeiram a otimização de 2 ou mais variáveis. (SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997).
Figura 11. Plotagem da retenção de compostos (log k) vs. força da fase móvel (%B). Fonte: SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH. (1997)
Um pequeno número de separações iniciais são realizadas com variação de uma ou mais condições experimentais. Como exemplo, duas corridas de HPLC com diferentes valores de %B (para uma fase móvel binária A/B). Tempos de retenção e condições de corrida são em seguida processados no computador, e predições de separação como uma função da %B se tornam possíveis (DOLAN, 1992).