2.1 Geral
Avaliar a capacidade de otimização do software HIPAC (Phenomenex®, Torrance, USA), aplicando-o a uma mistura de oito flavonóides estruturalmente relacionados.
2.2 Específicos
Avaliar a exatidão do módulo HIPAC-G na previsão de parâmetros de retenção para uma mistura de flavonóides com separação em modo gradiente.
Avaliar a exatidão do módulo HIPAC-B na previsão de parâmetros de retenção para uma mistura de flavonóides com separação em modo isocrático.
Avaliar a exatidão do módulo HIPAC-S na previsão de parâmetros de retenção para uma mistura de flavonóides com separação em modo isocrático.
Avaliar as mudanças promovidas na separação pela alteração das condições dos experimentos, como tipo do solvente orgânico, força eluotrópica do solvente, colunas e fluxo.
3. METODOLOGIA
3.1 Instrumental
No desenvolvimento do trabalho foi utilizado um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diodos (CLAE-DAD) (Shimadzu, Japão) nas seguintes configurações: módulo controlador SCL-10Avp, duas bombas LC-6AD, detector SPD-M10Avp e injetor manual Rheodyne 7725i com um loop de 20 µL. As colunas cromatográficas usadas foram da marca Shim-pack C8 e C18 (25 cm e de 15 cm x 4,6 mm x 5 µm), com pré-coluna Shim-pack, C-18, 4,0 mm.
3.2 Substâncias e Solventes
Como solventes: acetonitrila (ACN), metanol (MeOH) da marca TEDIA Company® ,
água purificada através de sistema Milliq (Milipore) e ácido fórmico MERCK®. As substâncias usadas foram os seguintes flavonóides: 3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L- ramnopiranosil]-7-O-α-L ramnopiranosilkanferol (SAS1336), tilirosídeo, hesperidina, kanferol, quercetina, 3, 7, 8, 4'- tetra-O-metilgossipetina (SPEA01), 3, 7, 8, 3', 4'-penta-O- metilgossipetina (SPEA01Me), 3, 7, 3', 4'-tetra-O-metilquercetina (SPEH01) obtidos previamente de fontes naturais, isolados e identificados pelo grupo de pesquisa da Profa. Dra. Tania Maria Sarmento da Silva.
3.3 Uso do Software de Simulação
O software avaliado foi o HIPAC (Phenomenex®, Torrance, USA) programa
desenvolvido para auxiliar na busca de metodologias de testes em HPLC, com intuito de economizar tempo e recursos nos exames de rotina de laboratórios. É composto de 4 módulos HIPAC-B, HIPAC-TQ, HIPAC-G e HIPAC-S; cada um proposto a auxiliar certo aspecto dos experimentos tais como tipo e força do solvente, combinações de solventes (Ternários e Quaternários), modalidade de experimento (Isocrático, Gradiente), bem como aspectos do sistema (fluxo, comprimento da coluna, tipo de coluna).(HITCHEN, 1994c; d; b; a)
A condução dos experimentos foi direcionada com a finalidade de fazer uma comparação geral entre os dados de predição adquiridos no programa HIPAC, com os dados reais obtidos no cromatógrafo.
3.3.1 Determinação do Tempo de Retardo do Sistema (System Delay Time)
O primeiro experimento foi o da obtenção do valor do tempo de retardo do sistema (que corresponde ao tempo necessário para que a mudança na composição de solvente efetuada no modo gradiente chegue efetivamente ao início da coluna cromatográfica). Para realizar o cálculo foram realizados os seguintes passos:
1- Conectou-se a saída da válvula de injeção diretamente à entrada do detector usando um tubo de pequeno comprimento;
2- Preparou-se como fase móvel: Reservatório A: Metanol
Reservatório B: Metanol + 0,1 % acetona.
3- Com uma taxa de fluxo em um valor adequado de 1 mL/min, realizou-se um gradiente de 0 a 100% com tempo de gradiente de 20 minutos (TG=20 minutos).
4- O tempo de retardo do sistema pode ser calculado utilizando-se a relação: (tD) = t 0.5 –
(tG/2), aonde t0.5 é o tempo quando o gradiente registrado está à metade da distância entre os
pontos de início e fim como definidos no diagrama abaixo.
Figura 35. Gráfico demonstrativo da medição para o cálculo do tempo morto.
Obs.: O tempo de retardo de sistema só é determinado uma vez, para cada instrumento. (MARKOWSKI, 1990; HITCHEN, 1994; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997).
3.3.2 Obtenção dos dados de retenção nas corridas preliminares (trial runs)
A) Corridas preliminares para HIPAC-G.
O programa HIPAC necessita de dados para realizar as otimizações pertinentes ao desenvolvimento de método, que são o tempo de retenção (tR) dos analitos, assimetria do pico
(As), área (A) e a identificação de cada analito. Para obter estes dados, foram feitos dois experimentos iniciais que consistem em duas corridas cromatográficas em modo gradiente, sendo o primeiro um gradiente de 30 minutos e o segundo de 60 minutos, usando acetonitrila como eluente B e ácido fórmico 0,1% como eluente A, onde a concentração de ACN variou linearmente de 5 a 95% através dos respectivos tempos de gradientes, para ambos os gradientes. Após o término do tempo de gradiente, fez-se a redução da %B, de 95% para 5% no tempo de 5 minutos, e a %B foi mantida nesta última concentração por mais 10 minutos no intuito de reestabilizar a coluna ( SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH , 1997).
Após a obtenção dos cromatogramas, os dados adquiridos (tempo de retenção (tR),
assimetria do pico (As) e área (A), foram, juntamente com os dados das condições dos gradientes (tempo de gradiente, variação da concentração de B, modificador orgânico), inseridos no módulo HIPAC-G. As simulações que foram realizadas tiveram o objetivo de buscar a melhor resolução global média entre os analitos. Os resultados foram analisados na forma de cromatogramas simulados, mapas de resolução e tabelas com dados simulados de retenção e comparados com os dados obtidos experimentalmente (HITCHEN, 1994b; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997).
B) Corridas preliminares para HIPAC-B.
Na seqüência da avaliação dos módulos HIPAC, foram realizados experimentos com HIPAC-B, que tem como principal função predizer a condição de separação de substâncias em uma amostra com eluição em modo isocrático. Para realização dos experimentos no módulo HIPAC-B, seu tutorial indica a realização de duas corridas inicias em modo isocrático com a concentração de B em valores diferenciados entre 0 e 100%. Os dados são coletados de forma similar ao que é feito para o módulo HIPAC-G. As corridas cromatográficas foram realizadas com 60 e 70% de B. De forma subseqüente e análoga ao realizado com o HIPAC- G, os dados foram inseridos no módulo HIPAC-B, onde o mesmo fez as predições das condições de separação e simulação dos cromatogramas a serem comparados aos obtidos no cromatógrafo (HITCHEN, 1994a; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997).
C) Corridas preliminares para HIPAC-S.
O módulo HIPAC-S é utilizado após a obtenção da melhor predição nos módulos HPAC-G e HIPAC-B, no intuito de otimizar o sistema para o ganho de tempo sem perda (se possível) de resolução. O software requer dados pertinentes ao cromatograma utilizado, tais como: tempo de retenção (tR), assimetria do pico (As), área (A) somados a informação
relacionada às características do sistema (comprimento e diâmetro da coluna, tipo de empacotamento, tamanho da partícula, fluxo, temperatura, par de picos críticos, peso molecular estimado deste e concentração de B da corrida otimizada). Em seguida pode-se fazer a otimização de diferentes parâmetros como fluxo, comprimento da coluna e diâmetro da partícula e conseqüente obtenção de cromatogramas simulados com condições sugeridas para efetuação em cromatografo (HITCHEN, 1994c; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997).