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Os níveis de ecotoxicidade dos lixiviados das escórias foram determinados por recurso aos seguintes parâmetros ecotoxicológicos:

a) Ensaios de curta duração ou de toxicidade aguda:

i) Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri – As bactérias da espécie V. fischeri são microrganismo de águas salobras (zonas estuarinas) que se caracterizam pela emissão natural de luz (bioluminescência). Utilizando esta característica da bactéria, este ensaio baseia-se na avaliação do decréscimo da emissão de luz, quando aquela se encontra em contacto com concentrações crescentes de substâncias tóxicas.

A utilização deste bioindicador, no caso em estudo, tem como principal objectivo a avaliação da presença de substâncias tóxicas, para o metabolismo da bactéria, nos lixiviados das escórias e dos novos materiais desenvolvidos.

Sob o ponto de vista teórico, a inibição da bioluminescência da bactéria V. fischeri pode ser traduzida por uma relação matemática simples, entre a concentração de uma substância tóxica, C, e a resposta deste bioindicador, medida em termos de emissão de luz (Microbics Corporation, 1992). Quando essa resposta é medida em termos de valores gama, Γ, a relação matemática é dada pela seguinte expressão:

p t =k.C

Γ (4.1)

na qual, k é um factor compósito, relacionado com a energia livre e as alterações de volume da reacção envolvida, e p é o número de moléculas de uma dada substância tóxica, por cada local alvo. O valor de Γt representa a razão entre a luz

emitida pelas bactérias, no ensaio de controlo, no tempo t, Itc, e a luz emitida pelas bactérias em contacto com uma dada concentração da amostra em estudo, no mesmo tempo t, Ita, menos uma unidade (expressão 4.2).

1 I I ta tc t = − Γ _(4.2)

A estimativa da concentração de uma dada substância tóxica pode ser efectuada a partir dos valores de Γt, reescrevendo a equação 4.1 na forma linear (expressão 4.3). a log log . b C log = Γ_t + _(4.3)

A equação 4.3 é utilizada para estimar a concentração de um tóxico, para um determinado efeito nominal. Por exemplo, um valor de gama igual à unidade corresponde a uma redução da emissão de luz igual a 50%. A concentração da substância tóxica, para a qual este valor de gama foi observado, será igual ao valor do parâmetro CE50.

Estes ensaios foram realizados num sistema automatizado, da marca “Microtox®”, tendo as bactérias da espécie V. fischeri sido fornecidas, em estado de latência, por congelação a seco, pela “Microbics Corporation”. O tempo máximo de exposição das bactérias, a diferentes concentrações dos lixiviados, foi de 30 min.

Os ensaios foram realizados de acordo com a versão preliminar da norma internacional ISO 11348-3 (2003), a qual se encontra já aprovada, na sua versão definitiva, desde Julho de 2003. Os valores de CE50 (30 min) foram determinados através de uma curva dose-resposta, pela utilização da equação 4.3. A sensibilidade das bactérias foi ensaiada pela utilização do padrão fenol;

ii) Inibição da mobilidade do crustáceo Daphnia magna – Os organismos da espécie D. magna são microcrustáceos dos ecossistemas hídricos dulciaquícolas, que fazem parte do zooplâncton desses ecossistemas. Encontram-se, por isso, num dos primeiros níveis das cadeias alimentares dos sistemas de água doce.

Estes organismos são caracterizados por possuírem mobilidade própria, que pode ser inibida pela presença de substâncias tóxicas no meio de cultura.

Face a esta característica fisiológica, este ensaio tem como objectivo a determinação da concentração inicial de uma substância, que induz a imobilização de 50% dos indivíduos expostos, num período de 48 horas. Esta concentração designa-se por concentração de inibição inicial efectiva, ou, de forma abreviada, CE50 (48 h).

No caso dos lixiviados das escórias e dos novos materiais, o objectivo associado à utilização deste ensaio consistiu em determinar as concentrações dos lixiviados que provocam essa percentagem de imobilização, para o mesmo período de exposição.

Todos os ensaios foram realizados com organismos da espécie D. magna, cultivados no Laboratório de Ecotoxicologia da UBiA/FCT/UNL, obtidos na terceira geração, por partenogénese acíclica, e com uma idade máxima de 24 h. A cultura inicial de D. magna foi fornecida pelo Departamento de Aquacultura do ex-Instituto Português de Investigação Marítima (ex-IPIMAR).

Todas as amostras dos lixiviados foram ensaiadas em duas fases sucessivas:

1 – Ensaios preliminares: Nestes ensaios, foram testadas gamas relativamente alargadas de concentração dos lixiviados. O objectivo consistia em obter um intervalo de concentrações, onde se localizasse o valor de CE50 (48 h);

2 – Ensaios definitivos: Os intervalos de concentrações, obtidos nos ensaios preliminares, foram testados nos ensaios definitivos, por forma a determinar-se, com rigor, o valor de CE50 (48 h);

Para cada uma das amostras dos lixiviados e por cada um dos ensaios anteriormente referidos, foi testado um número mínimo de cinco concentrações dos lixiviados. Por cada uma dessas concentrações, utilizou-se um número de 20 indivíduos de D. magna, numa carga máxima de 5 organismos, por cada 10 mL de solução a ser ensaiada. Os ensaios foram realizados sem renovação do meio. A sensibilidade dos organismos foi periodicamente verificada, por utilização de uma solução padrão de dicromato de potássio.

Os valores de CE50 (48 h) foram calculados com base no método probabilístico “probit”, disponível na versão 1.5 do programa “Probit Analysis”, da USEPA.

As condições de cultura dos organismos da espécie D. magna e as condições dos ensaios satisfizeram aos requisitos técnicos da norma internacional ISO 6341 (1989);

b) Ensaios de longo termo ou de toxicidade crónica:

iii) Inibição do crescimento da microalga Pseudokirchneriella subcapitata (anteriormente designada por Selenastrum capricornutum) – Estes microrganismos são algas verdes que fazem parte do fitoplâncton dos ecossistemas dulciaquícolas, caracterizando-se por apresentarem sensibilidade à presença de algumas substâncias químicas no meio de cultura. Essa sensibilidade traduz-se, habitualmente, pela diminuição das taxas de crescimento, quando comparadas com as taxas registadas na situação de ausência dessas substâncias no meio de cultura. Esta sensibilidade metabólica permitiu desenvolver este ensaio de ecotoxicidade, para substâncias solúveis em água e para efluentes residuais ou lixiviados. O objectivo deste ensaio consiste em avaliar e quantificar o efeito que concentrações crescentes, de uma dada substância, apresentam no crescimento de uma população das microalgas.

Neste ensaio, as microalgas foram cultivadas em cultura descontínua, durante várias gerações. Os meios de cultura eram constituídos por concentrações não limitantes de macro e micronutrientes e por concentrações crescentes dos lixiviados das escórias. O inóculo inicial das microalgas provinha de uma cultura mãe que se encontrava em condições de crescimento exponencial.

Durante um período de 72 h, foi medida, duas vezes por dia, a densidade celular, em cada um dos meios, contendo diferentes concentrações dos lixiviados. Estas densidades foram medidas indirectamente, pelo registo da absorvância da luz, com um comprimento de onda de 560 nm, em cada um dos meios de cultura. Foi previamente estabelecida uma curva média de correlação directa, entre o número de células, por unidade de volume, e a absorvância, a 560 nm, de quatro culturas mãe em crescimento descontínuo.

A incubação de todas as culturas foi realizada a 23±2ºC, com agitação contínua e com intensidade luminosa permanente, de cerca de 7000 lux.

Para cada uma das culturas, foi determinada a taxa específica de crescimento, com base na seguinte relação matemática:

t . o t X .e

X = −µ (4.4)

na qual, Xt, representa a concentração de biomassa, no tempo t, na fase de crescimento exponencial (expressa em massa por unidade de volume), Xo, a concentração de biomassa no início da fase de crescimento exponencial (expressa em massa por unidade de volume), e µ, a taxa específica de crescimento (expressa em tempo-1). Existindo uma relação directa entre a concentração de células e a absorvância do meio, Xt e Xo são representados pelos respectivos valores de absorvância.

A percentagem de inibição da taxa específica de crescimento, para a concentração

i de um dado lixiviado, Iµi, foi calculada em função da taxa específica de

crescimento, determinada para o ensaio de controlo, µc, e da taxa específica de crescimento calculada para a concentração i, desse mesmo lixiviado. A expressão utilizada foi a seguinte:

100 . I c i c i _µ µ − µ = µ (4.5)

Os valores das concentrações iniciais efectivas, para 20% e 50% da população de microalgas, CE20 e CE50 (72 h), respectivamente, foram determinadas através de regressões lineares, efectuadas sobre gráficos semi-logarítmicos, do logaritmo da concentração de um dado lixiviado em função da percentagem de inibição da taxa específica de crescimento, por utilização do método matemático dos mínimos quadrados.

Todos os ensaios foram realizados em triplicado e cumpriram os requisitos técnicos da norma ISO 8692 (1989). A cultura “stock” das microalgas foi fornecida pelo Departamento de Aquacultura do ex-IPIMAR.

iv) Inibição da germinação de sementes da espécie Lactuca sativa (alface) – Algumas substâncias químicas apresentam propriedades tóxicas em relação a plantas superiores. Um desses efeitos resulta da entrada dos tóxicos para o interior das sementes e traduz-se pela inibição do processo de germinação da plântula.

Uma das espécies vegetais utilizadas para avaliar este efeito tóxico é a Lactuca sativa, vulgarmente conhecida por alface.

O objectivo deste ensaio consistiu na avaliação do efeito tóxico dos lixiviados sobre a faculdade germinativa de sementes viáveis de alface.

As sementes foram cultivadas em areia destinada a ensaios laboratoriais, de granulometria igual a 0,5 mm, previamente descontaminada com ácido nítrico e água desmineralizada. A areia era da marca “Panreac”.

Cada um dos meios de cultura continha 200 g de areia e 40 mL de uma solução contendo uma concentração específica de um dos lixiviados. A carga vegetal aplicada foi de 50 sementes, por 200 g de areia.

A incubação das unidades de ensaio foi realizada a uma temperatura de 21±2ºC, com uma intensidade luminosa de 7000 lux e com um fotoperíodo de 12 h. No final do período de incubação (7 d), procedeu-se à contagem das sementes germinadas, em todas as unidades de ensaio.

A percentagem de inibição da germinação, em cada unidade de ensaio, foi calculada em função do número de sementes germinadas no ensaio de controlo (ensaio sem lixiviado). Todas as unidades de ensaio foram construídas em triplicado.

Os valores das concentrações dos lixiviados, que provocaram inibição da germinação em 50% da população de alfaces (CI50), foram calculados com base no método probabilístico “probit”, disponível na versão 1.5 do programa “Probit Analysis”, da USEPA.

As sementes de alface utilizadas eram da variedade “Batavia odyssey” e foram fornecidas pela empresa “Germiplanta”. A capacidade de germinação destas sementes foi avaliada nos ensaios de controlo e a sua sensibilidade foi testada com uma solução de referência de cloreto de mercúrio (II).

Os procedimentos para a realização destes ensaios seguiram as especificações técnicas da norma francesa NF X31-201 (1982).