Entre as proteínas que auxiliam a desconstrução de polissacarídeos constituintes da biomassa lignocelulósica, as expansinas e as expansinas-like têm recebido atenção especial. As expansinas são proteínas não hidrolíticas encontradas na parede celular das plantas e também ocorrem em outros organismos, como bactérias, fungos, nematóides, amebas, moluscos e vírus, sendo denominadas expansinas-like (FAVARO & POLETTO, 2013; COSGROVE, 2017). Nas plantas, as expansinas estão envolvidas em diferentes respostas fisiológicas e ambientais, como crescimento de folhas e caule, abertura e fechamento de estômatos, reprodução, amadurecimento e tolerância a estresses (SANTIAGO et al., 2018). Elas rompem as ligações não covalentes entre as microfibrilas de celulose e os demais polímeros da matriz por um mecanismo não enzimático, levando ao afrouxamento e extensão da parede celular (SAMPEDRO & COSGROVE, 2005). Devido às suas caracaterísticas, elas têm sido estudadas para diferentes aplicações, tais como na desconstrução de biomassas lignocelulósicas, e em outras aplicações que demandam alterações nas propriedades químicas e físicas da celulose.
As expansinas contêm de 250 a 275 aminoácidos e possuem dois domínios antecedidos por um peptídeo sinal (Figura 8). O domínio 1 tem homologia distante com proteínas da família glicosil hidrolase 45 (GH45). Ele é localizado na região N-terminal da proteína e possui estrutura do tipo double-psi beta-barrel (DPBB). Esse domínio é acoplado à um domínio C-terminal (domínio 2) (Figura 8) homólogo aos alérgenos de pólen de gramíneas do grupo 2, que são de função biológica desconhecida (YENNAWAR et al., 2006; CROSGROVE, 2005).
Figura 8. Estrutura de proteínas homólogas aos dois domínios das expansinas de plantas. (a) Domínio
de Expansina 1 (a figura mostra o domínio catalítico de uma endoglicanase da família GH45 do fungo filamentoso ascomiceto Humicola insolens; com o domínio double-psi beta-barrel - DPBB; os resíduos de aminoácidos que são conservados em expansinas estão indicados no código de aminoácidos (letras). (b) Domínio de Expansina 2 (a figura mostra uma proteína G2A de Phleum pratense, a qual é um tipo de alérgeno de pólen de gramíneas do grupo 2). Fonte: SAMPEDRO & COSGROVE (2005).
As expansinas fazem parte de uma superfamília dividida em quatro subfamílias: α- expansinas (EXPA), β-expansinas (EXPB), expansinas-like A (EXLA) e expansinas-like B (EXLB). As α-expansinas e β-expansinas são conhecidas por afrouxarem a estrutura da parede celular e por estarem envolvidas em outros eventos do desenvolvimento da planta (SAMPEDRO & COSGROVE, 2005; COSGROVE, 2017). A expressão das expansinas é diferencialmente regulada nas fases de desenvolvimento da planta por hormônios e também por fatores ambientais (CHO & COSGROVE, 2002; SANTIAGO et al., 2018).
O modelo de afrouxamento da parede celular pelas expansinas é exemplificado na Figura 9. Considera-se que a proteína tenha capacidade de perturbar as ligações de hidrogênio entre as microfibrilas de celulose. O estresse resultante da ação da expansina resulta no deslocamento dos polímeros da parede e no deslizamento nos pontos de aderência (CROSGROVE, 2000).
Figura 9. Esquema de afrouxamento da parede celular vegetal pela ação de expansinas (estrutura em
cor azul nas figuras a, b e c). As microfibrilas de celulose são conectadas umas às outras por glicanos (fitas amarelas e vermelhas) que podem aderir na superfície da microfibrila e entre si. A hipótese é tal que a expansina (azul) pode perturbar a ligação dos glicanos à superfície da microfibrila (a) ou entre si (b). Sob o estresse mecânico resultante do turgor, a ação da expansina resulta em um deslocamento dos polímeros da parede (c) e desliza nos pontos de adesão do polímero (comparação entre a e c). Fonte: COSGROVE (2000).
Uma das principais barreiras encontradas pelas enzimas celulolíticas é o acesso limitado às moléculas de celulose que permanecem na porção interior das microfibrilas (ARANTES & SADDLER, 2010). Nesse aspecto, tem sido proposto que o afrouxamento de microfibrilas de celulose pela ação de proteínas não hidrolíticas, tais como as expansinas, pode facilitar o acesso das enzimas às fibras, aumentando a área disponível e tornando a sacarificação enzimática mais eficiente (BAKER et al., 2000).
Apesar de alguns esforços para caracterização bioquímica de expansinas de plantas, o número de expansinas-like microbianas caracterizadas e descritas como envolvidas no afrouxamento de celulose é maior do que as de origem vegetal (MARTINEZ-ANAYA, 2016). Algumas expansinas de plantas que aumentam a eficiência da hidrólise de celulose são
provenientes de pepino (Ex29 / Ex30), de milho (EXPB1) e de tomate (LeEXP2) (BAKER et al., 2000; LIU et al., 2014).
A escassez de estudos funcionais sobre expansinas de plantas se deve em parte à dificuldade de extração dessas proteínas a partir de tecidos vegetais e também à dificuldade de produzi-las em hospedeiros heterólogos na sua forma funcional e em quantidade suficiente para caracterização bioquímica e outras aplicações (LIU et al., 2015; COSGROVE, 2017).
Entre as poucas expansinas-like de origem microbiana caracterizadas até o momento, as mais estudadas são BsEXLX1 da bactéria Bacillus subtilis e swollenin (SWO) do fungo Trichoderma reesei, conforme as revisões de MARTINEZ-ANAYA (2016), de COSGROVE (2017) e de GEORGELIS et al. (2015). De fato, o foco da maioria dos estudos sobre expansinas de plantas e expansinas-like microbianas tem sido voltado para seu uso como um aditivo na sacarificação enzimática da celulose. Entretanto, essas proteínas têm potencial para uso em diferentes processos onde o afrouxamento de microfibrilas de celulose ou modificações das propriedades físicas e químicas da celulose sejam necessárias: i) Indústria de papel: para obtenção de polpa de celulose (PERE et al., 2006); para reciclagem de papel (LIAN-CHAO & COSGROVE, 2004); para modificar as fibras da polpa e aumentar a taxa de absorção de água de folhas de papel fabricadas com a polpa tratada com expansinas (MA & TAUSCHE, 2013); ii) Indústria têxtil: para impregnação de corantes nas fibras (COSGROVE; TAKEDA, 2007); para fabricação, tratamento e acabamento de têxteis à base de celulose (BERENDES et al., 2001); iii) Indústria de alimentos e rações animais: tecnologia para aumentar o desempenho de utilização das fibras ou a fermentação ruminal (LI et al., 2019; ADESOGAN et al., 2019).
Assim, para explorar todo o potencial das expansinas e das expansinas-like em biorrefinarias de lignocelulose, é fundamental que meios e métodos que viabilizem a produção recombinante dessas proteínas sejam desenvolvidos.
2.4. PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE EXPANSINAS E DE EXPANSINAS-LIKE