Para a caracterização enzimática dos fungos foram realizados testes de crescimento e de degradação em meio de cultura sólido contendo diferentes polissacarídeos como fonte de carbono: carboximetilcelulose (CMC sodium salt, low viscosity, Sigma-Aldrich), xilana de madeira de faia (Sigma-Aldrich), pectina (from citrus peel, Sigma-Aldrich), amido solúvel (Sigma-Aldrich) e celulose microcristalina (Avicel PH-101, Sigma-Aldrich). Cada uma das 291 cepas foi retirada do estoque e inoculada em placas de Petri (90 x 15 mm) contendo meio de cultura BDA (Sigma-Aldrich). A incubação foi realizada a 25°C por sete dias. Essa condição de cultivo foi escolhida com base na análise anterior de viabilidade e pureza dos fungos, pois demonstrou ser adequada para o crescimento e desenvolvimento de todas as cepas. Após o crescimento, os fungos foram transferidos para placas de Petri (90 x 15 mm) contendo 20 mL de meio de cultura (Meio Mínimo) contendo cada polissacarídeo a ser avaliado: 1% de carboximetilcelulose, xilana ou amido. Para avaliação da degradação de pectina utilizou-se meio mínimo com 0,5% de pectina, ajustado para pH 5 e 7. A preparação destes meios de cultura e a análise estatística dos experimentos são descritas a seguir.
Para a avaliação, foi utilizada a solução de sais de A. nidulans (PONTECORVO et al., 1953) a qual contém (g/L): NaNO3 6,0; KCl 0,5; KH2PO4 1,5; MgSO4 0,5; ZnSO4 0,001;
FeSO4 0,001. A esta solução foram adicionados 10 g/L de celulose microcristalina e o pH foi ajustado para 6,8. Ágar bacteriológico foi adicionado (15 g/L) e o meio foi esterilizado em autoclave. A inoculação foi realizada pela transferência de um disco de micélio de oito mm de diâmetro para o centro das placas de Petri. A incubação foi realizada por 4 dias a 25°C e após este período os diâmetros das colônias foram mensurados com auxílio de paquímetro digital (diâmetro perpendicular). O delineamento foi do tipo inteiramente casualizado com três repetições. Os dados de crescimento em Avicel foram analisados com o software Genes (CRUZ, 2008), com análise de variância seguida de comparação das médias por meio do teste de Scott-Knott (1974) para separar as médias em grupos, ao nível de 5% de significância.
Os meios de cultura contendo CMC, xilana e amido foram preparados com solução de sais de A. nidulans (PONTECORVO et al., 1953) descrita anteriormente. A esta solução de sais foram adicionados, respectivamente, 1% de CMC, 1% de xilana e 1% de amido como fontes de carbono. O pH foi corrigido para 6,8 e ágar bacteriológicofoi adicionado (15 g/L). Após a esterilização em autoclave, 0,1% de Triton X-100 esterilizado foi adicionado aos meios de cultura com o intuito obter melhor visualização do halo, para que o crescimento não fosse total na placa e fosse possível mensurar a degradação enzimática em cada substrato.
O meio de cultura para avaliação da degradação de pectina foi preparado de acordo HANKIN & ANAGNOSTAKIS (1975). O meio de cultura é composto por (g/L): extrato de levedura 1,0; pectina cítrica 5,0; ágar 20,0 e 50 mL de solução de sais 10x concentrada. A solução de sais 10x concentrada foi preparada com: 20 g/L de (NH4)2SO4; 40 g/L de KH2PO4; 60 g/L de Na2HPO4; 2 g/L de FeSO4; 0,01 g/L de CaCl2; 0,0001 g/L de H3BO3, 0,001 g/L de MnSO4; 0,0001 g/L de ZnSO4; 0,005 g/L de CuSO4. Após a homogeneização de todos os reagentes, o pH foi corrigido para 5,0 e para 7,0 e, após esterilização, foi adicionado 0,1% de Triton X-100 esterilizado ao meio. O meio de cultura com pH 5,0 é indicado para a detecção de poligalacturonase e o meio com pH 7,0 para detecção de pectina liase.
Todas as 291 cepas foram inoculadas em triplicata nos 5 meios de cultivo (CMC, xilana, amido, pectina pH 5,0 e pectina pH 7,0) e foram incubadas a 25°C por 6 dias. Em seguida, as placas foram examinadas para determinação do índice enzimático, conforme descrito a seguir: a) Xilana e pectina (pH 7,0 e 5,0): Primeiramente delimitou-se a região do crescimento do fungo (diâmetro da colônia). Posteriormente, 5 mL de solução de iodo (iodeto de potássio: 3 g; iodo ressublimado: 1g; água destilada: 100 mL) foram adicionados na superfície e as placas foram deixadas em repouso à temperatura ambiente por 15 min e posteriormente foram lavadas com água destilada; o halo de degradação (diâmetro do halo) foi mensurado com auxílio de paquímetro digital. b) Amido: Após a delimitação da região do
crescimento do fungo, aproximadamente 5 mL de solução de iodo foram adicionados nas placas, as quais foram imediatamente lavadas com água destilada para revelação dos halos de degradação; o halo de degradação foi mensurado com auxílio de paquímetro digital. c) CMC: Após delimitar a região do crescimento do fungo, cerca de 10 mL de solução de vermelho congo (0,1%) foram adicionados na superfície das colônias e as placas permaneceram em repouso por 30 min à temperatura ambiente; posteriormente foi realizada a lavagem das placas com uma solução de NaCl 1M; o halo de degradação formado foi mensurado.
A degradação enzimática dos substratos foi determinada por meio do cálculo do índice enzimático (IE), que consiste na razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro das colônias (IE: diâmetro do halo/ diâmetro da colônia). Os dados de IE foram analisados com o software Genes (CRUZ, 2008); foi realizada análise de variância seguida de comparação das médias por teste de Scott-Knott (1974), ao nível de 5% de significância.
Com base na análise estatística dos dados de caracterização enzimática, linhagens foram selecionadas considerando os seguintes critérios: maiores diâmetros de crescimento em meio contendo celulose microcristalina; maiores valores de índice enzimático em meio contendo os polissacarídeos CMC, amido, xilana e pectina (com pH 5,0 e pH 7,0); tipo de perfil de degradação de polissacarídeos (degradação exclusiva e/ou simultânea dos polissacarídeos); classificação taxonômica. Adicionalmente às análises estatísticas, gráficos do tipo heatmap (construídos em planilhas Microsoft Excel utilizando a feramenta de formatação condicional) foram obtidos para melhor visualização das classes fenotípicas obtidas (definidas com base no perfil de degradação dos polissacarídeos CMC, xilana, pectina e amido, e nas médias de crescimento em celulose microcristalina). Esta metodologia para seleção de cepas com base na produção de enzimas em meio contendo diferentes polissacarídeos foi escolhida pois acredita-se que os fungos selecionados podem ter potencial para degradar os componentes da biomassa lignocelulósica. Porém vale ressaltar que existem gargalos como estabilidade e inibições que podem interferir nesse processo.
Dessa forma, 27 linhagens foram definidas para avaliação em uma segunda etapa, no cultivo em fermentação submersa tendo bagaço pré-tratado por autohidrólise como fonte indutora da produção de enzimas. Em seguida, os 27 extratos brutos obtidos (secretomas) foram submetidos à quantificação de atividades enzimáticas e aqueles extratos com maior valor de FPase foram avaliados quanto a liberação de açúcares redutores na hidrólise do bagaço pré-tratado por autohidrólise.
3.2.3.2. Triagem secundária: obtenção de extrato enzimático (secretoma) de cepas