A caracterização enzimática de 291 fungos endofíticos de P. cupana e R. mangle foi realizada como parte de uma estratégia para seleção de cepas promissoras quanto à degradação de polissacarídeos. Essa triagem primária teve como foco a determinação do índice enzimático e do perfil de degradação dos polissacarídeos carboximetilcelulose (CMC), amido, xilana e pectina, sendo que a capacidade de crescimento em celulose microcristalina também foi investigada. A prospecção de fungos produtores de enzimas por meio de testes em meio sólido é uma estratégia simples e rápida para análise de um grande número de cepas (POINTING, 1999). A produção de zonas de clareamento do substrato ao redor da colônia indica a despolimerização dos polissacarídeos pelas enzimas secretadas (ZHANG et al., 2006;
HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975).
Os resultados da determinação do índice enzimático em 5 substratos diferentes, bem como da capacidade de crescimento em celulose microcristalina dos 291 fungos são mostrados no Anexo 1.
Com relação à determinação do índice enzimático em diferentes substratos verificou- se que mais de 80% das linhagens avaliadas foram capazes de degradar pelo menos um dos polissacarídeos avaliados (carboximetilcelulose, xilana, pectina em pH 5, pectina em pH 7 e amido) (Figura 11). Essa degradação foi evidenciada por valores de índice enzimático maiores que 1, o que é indicativo de secreção de endoglicanase, xilanase, poligalacturonase, pectina liase e amilase, respectivamente (Figura 11). Ao todo, de 291 linhagens, 87,97% produziram endoglicanase, 91,75% produziram xilanase, 91,06% produziram poligalacturonase, 93,81% produziram pectina liase e 85,22% produziram amilase. Apenas 7 (2,4%) cepas não cresceram em nenhum dos 5 meios de cultura utilizados (Anexo 1).
A análise estatística revelou diferenças significativas entre as cepas (p < 0,01) quanto à capacidade de produção de enzimas (Anexo 1). Os fungos que apresentaram valores de índice enzimático maiores que 1 em pelo menos 1 dos substratos puderam ser agrupados em classes fenotípicas, conforme o perfil de degradação de polissacarídeos (simultânea de 2 ou mais substratos, ou exclusiva de 1 dos polissacarídeos testados) (Anexo 1).
Figura 11. Porcentagem de fungos endofíticos de P. cupana e R. mangle (total de 291 linhagens) que
apresentaram índice enzimático (IE) > 1 quando cultivados por 6 dias a 25°C em meio sólido contendo diferentes polissacarídeos como única fonte de carbono. Carboximetilcelulose (CMC), xilana, pectina (pH 5,0), pectina (pH 7,0) e amido são substratos utilizados para detecção preferencialmente de endoglicanase, xilanase, poligalacturonase, pectina liase e amilase, respectivamente.
Das 214 cepas produtoras de amilase (isto é, que apresentaram IE > 1 em amido), 4 delas apresentaram os maiores valores de IE (2,68 a 4,14) e foram identificadas como Neopestalotiopsis, Neofusicoccum, Paraconiothyrium e Clonostachys. Das 256 linhagens que
degradaram xilana, 18 delas (~~7%) apresentaram os maiores valores de IE (2,96 a 5,26) e pertencem aos gêneros Paraconiothyrium, Annulohypoxylon, Neopestalotiopsis, Aspergillus, Clonostachys, Talaromyces, Sarocladium, Neofusicoccum, e Diaporthe. Em relação à produção de pectinases, das 252 cepas produtoras de poligalacturonase, 13 delas (~~5%) apresentaram os maiores valores de IE (2,76 a 4,03), com destaque para cepas classificadas como Neopestalotiopsis, Annulohypoxylon, Diaporthe e Neofusicoccum, entre outras cepas não identificadas. Já entre as 258 cepas produtoras de pectina liase, 16 delas (~~6%) apresentaram os maiores IE (3,25 a 6,36) e foram classificadas como Paraconiothyrium, Neopestalotiopsis, Aspergillus, Neofusicoccum, Agaricales, Clonostachys, Diaporthe, Phialemonium, Talaromyces, Xylariales e Cordyceps.
Com relação à produção de celulases (endoglicanase), das 237 cepas produtoras, 27 delas (~~11%) apresentaram os maiores valores de IE (2,75 a 4,18) e foram classificadas como Aspergillus, Diaporthe, Neofusicoccum, Talaromyces, Fusarium, Clonostachys, e outras cepas não identificadas (Anexo 1).
Além da determinação do índice enzimático em meio contendo celulose solúvel (CMC), as 291 cepas também foram caracterizadas quanta à capacidade de crescer em celulose microcristalina como única fonte de carbono (substrato insolúvel). O crescimento nesse substrato indica a produção de celulases totais. Das 291 cepas, apenas 3 não cresceram neste substrato (Tabela 5; Anexo 1), e para as cepas que cresceram, o diâmetro variou de 0,85 mm até 85 mm. Das 288 cepas que cresceram em Avicel, aproximadamente 14% apresentaram crescimento máximo (75 a 85 mm) nas condições avaliadas (Anexo 1; Tabela 5), indicando o potencial desses fungos para degradar materiais celulósicos.
A análise estatística dos dados de crescimento em Avicel também revelou diferenças significativas entre as linhagens (Anexo 1). De modo geral, a maioria das linhagens classificadas como Neofusicoccum e Trichoderma apresentou crescimento superior na celulose microcristalina (> 75 mm), juntamente com alguns representantes de Annulohypoxylon, Clonostachys, Lasiodiplodia, Diaporthe, Fusarium, Neurospora, Paecilomycese Penicillium (Tabela 5). Também foi possível observar que, salvo algumas exceções, a maioria das cepas de Penicillium, Talaromyces, Aspergillus e Clonostachys apresentou menor crescimento em celulose microcristalina (Anexo 1). Também foi observado que as linhagens com maior capacidade de crescimento em Avicel não foram as mesmas que apresentaram os maiores valores de índice enzimático em meio contendo CMC (Anexo 1). Isso revela a importância de avaliar estes dois tipos de celulose (solúvel e insolúvel) em programas de bioprospecção de fungos celulolíticos.
Tabela 5. Diâmetro de crescimento de 291 linhagens de fungos endofíticos de P. cupana e R. mangle em meio contendo celulose microcristalina (Avicel PH-101) como única fonte de carbono, após 4 dias de crescimento a 25°C. *Teste de Scott-knott a 5% (p=0,005, 95%) de nível de significância. Crescimento (mm) Número de linhagens Classificação taxonômica 0,00 3 Diaporthe, Agaricales
0,85 a 9,95 25 Clonostachys, Diaporthe, Fusarium, Xylariales, Phialemonium, Talaromyces, Trametes, Trichoderma, Xylaria
10,21 a 29,97 73 Annulohypoxylon, Aspergillus, Clonostachys, Diaporthe, Dokmaia,Eutypa, Fusarium, Paecilomyces, Paraconiothyrium,
Penicillium, Talaromyces, Lasiodiplodia
30,08 a 49,70 96 Annulohypoxylon, Aspergillus, Clonostachys, Cordyceps, Diaporthe, Dokmaia,Fusarium, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Penicillium,
Talaromyces, Trichoderma
50,71 a 69,90 47 Fusarium, Neopestalotiopsis, Penicillium, Colletotrichum,Agaricales, Aspergillus
70,43 a 85,00 47 Annulohypoxylon, Clonostachys, Lasiodiplodia, Diaporthe, Fusarium, Neofusicoccum, Neurospora,Penicillium, Trichoderma, Paecilomyces
Com base nos resultados de índice enzimático, de crescimento em celulose microcristalina e de identificação taxonômica foram selecionadas 27 cepas para uma segunda etapa de triagem, com foco na produção de celulases e hemicelulases em cultivo em fermentação submersa e análise de desempenho de extratos enzimáticos (secretoma) na hidrólise de biomassa lignocelulósica. Embora tenha sido dada preferência para as linhagens com valores elevados de IE e de crescimento em celulose microcristalina, algumas linhagens com valores medianos foram também selecionadas por apresentarem um perfil de degradação completo, ou seja, foram capazes de degradar todos os polissacarídeos avaliados. Das 27 cepas selecionadas, 5 são de R. mangle e 22 de P. cupana.
As Figuras 12 e 13 resumem graficamente (heatmap) os dados de IE e de crescimento em celulose microcristalina, respectivamente, obtidos para as 27 cepas selecionadas para continuidade da bioprospecção (aproximadamente 10% do total de cepas). Para uma melhor identificação das 27 cepas selecionadas, outros genes marcadores taxonômicos foram sequenciados e avaliados. Os resultados da análise do gene EF1 contra diferentes bases de dados são apresentados no Anexo 2. As Figuras 12 e 13 mostram a classificação das cepas selecionadas com base nesses genes e no ITS rDNA, quando possível ao nível de espécie.
Neste trabalho foi realizada pela primeira vez uma ampla caracterização do perfil de degradação de polissacarídeos de fungos endofíticos de P. cupana e R. mangle, com uma triagem primária para selecionar linhagens para sacarificação de biomassa lignocelulósica. Como citado anteriormente, fungos endofíticos dessas plantas têm sido investigados quanto à produção de metabólitos bioativos.
O único trabalho que relata algum tipo de caracterização enzimática de fungos endofíticos de P. cupana é o de SILVA et al. (2018). Estes autores isolaram 37 cepas de P. cupana da Amazônia e avaliaram a produção de amilase e celulase usando testes qualitativos. A presença ou ausência de halo de degradação do substrato foi avaliada. Amilase foi produzida por espécies dos gêneros Pestalotiopsis, Diaporthe, Mycoleptodiscus, Fusarium, Mycena, Penicillium e Trichoderma. Celulase foi detectada para espécies dos gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis, Fomitopsis, Mycoleptodiscus, Paecilomyces, Arxiella, Fusarium, Penicillium, Trichoderma, Colletotrichum e Xylogone. Alguns desses gêneros também produziram amilases e celulases em condições semelhantes no presente trabalho (Anexo 1).
(CMCase) Enzimático Talaromyces amestolkiae CP230* 6 Neofusicoccum ribis 2G# 5 Diaporthe CED371* 4 Paraconiothyrium CE101/161* 3 Paraconiothyrium CE101* 2 Neopestalotiopsis CED409* 1
Annulohypoxylon stygium EP551/1*
Aspergillus pseudonomius EP593*
Trichoderma CE103*
Neopestalotiopsis CED334*
Neofusicoccum ribis 12G# Neofusicoccum BDA64 (9A)#
Neofusicoccum BDA6A (2A)#
Diaporthe BDA79(11A)#
Clonostachys rosea CED342*
Diaporthe CED382*
Diaporthe citri CED385*
Diaporthe CED413*
Diaporthe CED414*
Diaporthe CED432*
Clonostachys rosea CP256*
Annulohypoxylon stygium EP555*
Agaricales EP595*
Neofusicoccum EP650*
Clonostachys EP652*
Penicillium RZ478*
Figura 12. Representação gráfica (heatmap)dos valores de índice enzimático (médias) de 27 fungos endofíticos de P. cupana e R. mangle selecionados para
continuidade da bioprospecção visando à seleção de cepas produtoras de extrato enzimático eficiente para hidrólise de biomassa lignocelulósica. A classificação apresentada foi baseada na análise dos genes ITS1-5,8S-ITS2, EF1 e actina contra diferentes bases de dados.#Fungos de R. mangle; *Fungos de P. cupana.
Identificação molecular Linhagens Diâmetro da colônia em Avicel (mm)
Talaromyces amestolkiae CP230*
Neofusicoccum ribis 2G# Diâmetro da colônia
em Avicel (mm)
Diaporthe CED371*
Paraconiothyrium CE101/161* 80
Paraconiothyrium CE101* 70
Neopestalotiopsis CED409* 60-50
Annulohypoxylon stygium EP551/1* 40-30
Aspergillus pseudonomius EP593* 20
Trichoderma CE103* 10
Neopestalotiopsis CED334*
Neofusicoccum ribis 12G#
Neofusicoccum BDA64 (9A) #
Neofusicoccum BDA6A (2A) #
Diaporthe BDA79(11A) #
Clonostachys rosea CED342*
Diaporthe CED382*
Diaporthe citri CED385*
Diaporthe CED413*
Diaporthe CED414*
Diaporthe CED432*
Clonostachys rosea CP256*
Annulohypoxylon stygium EP555*
Agaricales EP595*
Neofusicoccum EP650*
Clonostachys EP652*
Penicillium RZ478*
Fusarium solani RZ482*
Figura 13. Representação gráfica (heatmap) dos valores médios de diâmetro (mm) das colônias após
crescimento em meio mínimo contendo Avicel PH-101 como única fonte de carbono de 27 fungos endofíticos de P. cupana e R. mangle selecionados para continuidade da bioprospecção visando à seleção de cepas produtoras de extrato enzimático eficiente para hidrólise de biomassa lignocelulósica. O experimento foi realizado em triplicata e os fungos foram incubados por 4 dias a 25°C. A classificação apresentada foi baseada na análise dos genes ITS1-5,8S-ITS2, EF1 e actina contra diferentes bases de dados. #Fungos de R. mangle; *Fungos de P. cupana.
Em relação aos fungos endofíticos de R. mangle, pode ser citado o trabalho de MAROLDI et al. (2018). Os autores avaliaram uma coleção de 41 fungos endofíticos de diferentes plantas de manguezal, entre elas R. mangle, quanto à capacidade de produção de celulases. A triagem inicial foi feita exclusivamente em meio mínimo sólido contendo Avicel como fonte de carbono. Todos os 11 fungos endofíticos de R. mangle avaliados (1 linhagem
de Aspergillus, 2 de Diaporthe, 1 de Fusarium, 4 de Trichoderma, 1 de Penicillium e 2 de Xylaria) foram capazes de crescer em celulose microcristalina, revelando sua capacidade de degradar materiais celulósicos. A análise foi do tipo presença ou ausência de crescimento após 7 dias, não sendo possível separar as cepas de crescimento lento ou vigoroso. No presente trabalho, o crescimento em Avicel foi verificado para todas as 35 linhagens endofíticas de R. mangle, sendo que o maior crescimento (> 75 mm) foi observado para cepas de Neofusicoccum e de Trichoderma provenientes dessa planta (Anexo 1).
Quanto à produção de enzimas degradadoras de polissacarídeos, as linhagens que apresentaram os maiores crescimentos em Avicel e os maiores índices enzimáticos em outros polissacarídeos pertencem à grupos taxonômicos que não têm sido tradicionalmente utilizados para produção de enzimas industriais, tais como Neofusicoccum, Paraconiothyrium, Diaporthe, Talaromyces, Neopestalotiopsis, Clonostachys, Annulohypoxylon. Esses fungos estão entre os 27 selecionados e sua capacidade de produção de enzimas bem como o desempenho de hidrólise de seus extratos enzimáticos são detalhados a seguir.
3.3.3. Produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas por 27 fungos endofíticos em