6. Bruk av vold og tortur i Statspolitiet Nord-Norge
6.1 Tilfellene av vold og bruk av tortur under avhør
Com o RNA total extraído das amostras, foi realizado o tratamento com DNAse (Ambion) seguindo as recomendações do fabricante e foi adicionado RNAseOUT INhibtor (Invitrogen). Este material tratado foi testado quanto à contaminação existente de DNA no aparelho de PCR em tempo real. Após ter sido confirmado a não contaminação de DNA nas amostras, o cDNA foi sintetizado utilizando 3 µg de RNA total, referente a cada amostra, utilizando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Ambion), de acordo com instruções do fabricante. Depois de sintetizado, foi adicionado 180µl de água tratada com DEPC 0,1%.
Para a avaliação do perfil de expressão gênica, foi realizada a quantificação com fluorescência através de SyBR Green e análise quantitativa relativa através do modelo matemático desenvolvido por Pfaffl (2001). Para a reação de PCR em tempo real foi utilizado 12 µl de SyBR Green Master Mix, 1 pmol de iniciadores (F+R), 7,5 ng de cDNA e água ultrapura até o volume de 20 µL. A sequência de todos os iniciadores que foram utilizados está na tabela 5. O primer RFLP2 foi o controle endógeno utilizado em todos os experimentos de qPCR deste trabalho.
Tabela 5. Iniciadores utilizados no RT- qPCR.
Nome dos
Iniciadores Foward Reverse
RPL2 5´ATT CCG TCA TCC TTT CAG
GTA CAA 3´ 5´ACT GTA CTG GCA TGA CCA ATG TGT 3´
H2A 5´TTG GCT GTG AGG AAT GAT
GA 3´ 5´GGC AAC AAA ACT GGG TTG AT 3´
PPO 5´TTC GAT GTG TTT TTG AAC
GTG GAC 3´ 5´TTT CCA TGA ACA TGA GGC AAG CTA 3´
CYP51 5´TGC TCC TGC AGC CTT ATC
TT 3´ 5´CAG GCT GCC ACA TAT CTT CA 3´
CAB 5´GCT TTT GCT GAG CTC AAG
GT 3´ 5´GAC CCT TTC CGG TGA CAA TA 3´
Proteinase Inhibitor II 5´CCT TGC CCC TTA AAT TGT
GA 3´ 5´GCA ACA CGT GGT ACA TCC AG 3´
113585F clone -
unknown 5´GGC TCT CGA CCA GAT TAA CG 3´ 5´CGT GGT GCA TCT CAA CAG AC 3´
Hsp20.2 5´TTT CTT TGG CTC AGG AGG
AG 3´ 5´TCT GCC AGA GAA TGC GAA TA 3´
ARP 5´AGC TAC CAG GAG AAT TGG
TGC TGA 3´ 5´TGC TTA GAT CTG GTG TTC CCA CTG 3´
LeCYP1 5´CAA GTT GTT GAA GGC ATG
GA 3´ 5´GTT GAC CGC AGT CAG CAA TA 3´
FA 5´AGA AGA GGG GAA GAG GAT
GAG GAA 3´ 5´GAT GCT CCC TTT GTC TCT CGC TTA 3´
SP 5´AGT GGT TGG GTA TGA AAT
GCC AAG 3´ 5´CTG GAC ACT GGT GCA CTC GAT ATT 3´
S 5´TCA CAT TCA AGG GGT TAC
TGT GGA 3´ 5´CAC GTT AAA CGG TCC TAT CCC AAC 3´
Foi utilizado o seguinte perfil de termociclagem: 50°C por 2 minutos; 95oC por 10 minutos; 40 ciclos de 80oC for 15 segundos e 60°C por 1 minuto, seguido de curva de melting. O desenho experimental envolveu 3 replicatas biológicas (RNA derivado de plantas diferentes) e quatro replicatas técnicas. As eficiências das PCRs foram calculadas utilizando o programa LinRegPCR (RAMARKERS et al., 2003) e os Cts foram normalizados de acordo com Pant
4. RESULTADOS:
Os ápices meristemáticos induzidos (reprodutivo) e não-induzidos (vegetativo) à floração das duas espécies estudadas: Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) e S. pimpinellifolium (SP) foram coletados para a construção da biblioteca subtrativa em tomateiro. Desta forma, foram geradas oito bibliotecas subtrativas a partir das hibridizações subtrativas daquelas amostras coletadas que foram nomeadas de acordo com a Tabela 6.
Em cada biblioteca referente à tabela 6, as primeiras amostras (sublinhadas) correspondem ao tester (mensagens únicas) e as segundas (em parênteses), aos driver, amostra de referência. Portanto, a biblioteca subtrativa 1 (B1) contêm mensagens específicas de MT vegetativo quando subtraídas de MT reprodutivo. A biblioteca subtrativa 3 (B3) apresenta mensagens específicas de MT reprodutivo quando subtraídas de MT vegetativo. A biblioteca subtrativa 5 (B5) corresponde as mensagens específicas de Sp vegetativo quando subtraídas de Sp reprodutivo e, assim por diante (Tabela 6).
Dentre estas, as bibliotecas B13 e B15 foram destacadas (Tabela 6, sublinhadas) por conterem genes relacionados à transição floral para as duas espécies de tomateiro utilizadas como alvo de trabalho. Além disso, foram obtidos entre 204 a 258 clones válidos sequenciados nas bibliotecas 7, 11, 13 e 15 e entre 121 a 195 clones sequenciados nas bibliotecas 1, 3, 5 e 9 (Tabela 6).
Tabela 6. Denominação das Bibliotecas Subtrativas e os respectivos números de clones obtidos.
MTV: cv Micro Tom (MT) Vegetativo; MTR: cv MT Reprodutivo; SPV: Solanum pimpinellifolium (SP) Vegetativo; SPR: SP Reprodutivo.
Biblioteca Subtração Número de Clones
B1 MTV - vegetativo (subtraído de MT reprodutivo) 121
B3 MTR - reprodutivo (subtraído de MT vegetativo) 195
B5 SPV - vegetativo (subtraído de SP reprodutivo) 181
B7 SPR - reprodutivo (subtraído de SP vegetativo) 258
B9 MTV - vegetativo (subtraído de SP vegetativo) 186
B11 SPV - vegetativo (subtraído de MT vegetativo) 204
B13 MTR - reprodutivo (subtraído de SP reprodutivo) 241
Os cDNAs foram pesquisados em bancos de dados do NCBI para análise de homologias e diversos genes relacionados ao desenvolvimento vegetal foram encontrados (Tabela 7). Sequências envolvidas à defesa da planta, proteínas envolvidas na síntese de tiamina, entre outras sequências bastantes representativas. A sequência homóloga ao gene ciclofilina e HTC in leaf foi identificada em todas as bibliotecas subtrativas. Dentre estes cDNAs, foi selecionado o homólogo à Proteína Reprimida pela Auxina (Auxin-repressed
protein) e à Ciclofilina (LeCYP1) para a caracterização in silico e funcional.
Ambos cDNAs foram identificados nas bibliotecas reprodutivas B13 e B15, sendo assim, estes cDNAs podem ser importantes para a floração em plantas de tomateiro por se tratarem de bibliotecas contendo informações referentes aos ápices reprodutivos de S. pimpinellifolium (que apresenta maior número de flores) e da cv. MT.
Tabela 7. Identificação dos Genes na Biblioteca Subtrativa. As sequências homólogas foram
pesquisadas no banco de dados do NCBI.
Prováveis sequências BlastX
B1 B3 B5 B7 B9 B11 B13 B15 Homologia Número de Acesso e value
0 0 2 0 0 0 15 1 Auxin-repressed protein (ARP1) DQ672601.1 7e-130
0 0 0 1 5 7 0 0 CyP51 (obtusifoliol 14α-demethylase) AY552551.1 2e-12
8 53 17 103 25 48 26 35 Cyclophilin AK246732.1 0.0
1 17 6 13 5 8 51 7 HTC in Leaf AK246942.1 0.0
14 1 7 9 64 10 0 0 Ribulose 1,5-bisphosphate X05983.1 4e-116
3 0 0 0 0 0 1 1 S-adenosylmethionine synthase Z24743.1 0.0
0 3 1 6 1 0 6 1 S-adenosylmethionine decarboxylase 3 (SAMDC3) EF550528.1 8e-87
0 1 0 0 1 10 0 0 Triose phosphate AY438596.1 0.0
0 2 0 0 0 0 0 0 Tubulin () AY633708.1 3e-25
12 0 1 0 3 0 5 0 Chloroplast thiazole biosynthetic protein THI1 AY220080.1 9e-56
0 0 0 1 0 0 0 5 Enolase X58108.1 2e-162
0 1 0 1 2 0 0 0 Tuber polyphenol oxidase PPO U22922.1 1e-56
0 2 0 0 0 3 0 0 Oxidase like protein U20596.1 0.0
8 0 0 0 0 0 0 0 Xyloglucan transferase D16456.1 0.0
13 6 68 31 3 30 38 21 Mitochondria (M) or Chloroplast genome (C) C-AM087200.3 M - BA000042.1 M 4e-178, C 0.0 11 6 9 2 2 9 7 8 Chlorophyll a/b (Cab protein) M30620.1 2e-171
2 1 4 0 0 2 0 0 Photosystem II X63007.1 6e-25
0 1 0 7 0 3 0 0 Heat shock protein Hsp90 and HSC70
AB112815.1
X54030.1 1e-102 2e-67,
0 0 0 8 0 0 0 0 ACTm RNA for actin AB199316.1 0.0
0 0 0 0 0 0 0 3 Ubiquitin X58253.1 5e-161
4 1 4 1 51 4 6 11 Transposable elements (DNA or RNA)
1 0 0 2 0 0 0 0 TaAGL29 MADS-box DQ512346.1 2e-15
1 2 0 7 2 1 14 0 Serine/Threonine kinase DQ459385.1 3e-10
1 3 19 2 2 17 4 3 Ribosomal protein DQ228355.1 0.0
0 2 0 1 0 0 0 0 Elongation factor 1-α DQ294264.1 4e-124 0 0 0 0 0 0 2 0 Initiation factor 2(IF2) AF296086.1 1e-61
0 1 4 0 0 0 4 0 Histone H4 AY346459.1 4e-35
0 0 0 1 0 0 1 0 Histone H2 (H2A and H2B) AJ224931.1
0 0 0 0 3 2 0 0 Histone H3 AK227612.1 2e-103
Os cDNAs obtidos foram divididos em diferentes classes quanto à homologia: metabolismo, energia, genoma mitocondrial e cloroplastos, elementos transponíveis, comunicação celular, dobramento, encurtamento e degradação de proteínas, transdução de sinais, transcrição, tradução, compactação do DNA. Estes cDNAs foram encontrados na maioria das bibliotecas estudadas. Assim como uma grande parcela de sequências desconhecidas (Tabela 8).
Tabela 8. Sequências identificadas organizadas em classes funcionais. MTV: cv Micro
Tom (MT) Vegetativo; MTR: cv MT Reprodutivo; SPV: Solanum pimpinellifolium (SP) Vegetativo; SPR: SP Reprodutivo. Classe B1 (%) MTV B3 (%) MTR B5 (%) SPV B7 (%) SPR B9 (%) MTV B11 (%) SPV B13 (%) MTR B15 (%) SPR Metabolismo 29.8 14.9 7.1 13.6 34.9 21.1 27.4 7.7 Energia 24.1 4.7 11.7 5.0 6.4 5.9 2.9 3.6 Genoma de Mitocôndria ou Cloroplasto 10.8 3.1 37.6 12.0 1.6 14.2 15.7 9.5 Elementos Transponíveis 3.4 0.5 2.2 0.4 27.4 2.0 2.5 5.0 Comunicação Celular 0 1.0 0 3.5 0 0.5 0.4 0 Dobramento, Encurtamento, Degradação 0 1.0 0 2.7 0 2.9 0.4 1.3 Transdução de Sinais 7.5 28.8 11.0 43.0 15.1 24.5 22.8 16.4 Transcrição 0.9 1.5 0 0.8 0 0.5 1.7 1.3 Tradução 1.8 2.0 10.5 1.6 1.6 8.8 1.7 0.9 Compactação do DNA 0 0.5 2.2 0.4 1.6 1.0 2.1 0 Sequências Desconhecidas 21.7 42.0 17.7 17.0 11.4 18.6 22.4 54.3 Os níveis de expressão de alguns genes encontrados nas bibliotecas subtrativas que supostamente estão envolvidos no processo de floração e genes conhecidos que participam da floração foram analisados em RT-qPCR a fim de averiguar a ação destes genes nos diferentes tecidos vegetativos (folha, caule e meristemas) das espécies Solanum pimpinellifolium e S. lycopersicum (cv. Micro-Tom) (Figura 9, 10 e 11).
A expressão de genes conhecidos como FALSIFLORA (FA), SELF-
meristemas apicais induzidos (MAR) e não induzidos a floração (MAV) das duas espécies estudadas (MT e SP).
Os níveis de expressão de FA em MT foram elevados nos meristemas induzidos a floração (MAR), enquanto que em S.pimpinellifolium os níveis não se alteraram entre os meristemas (MAR e MAV) (Figura 9A).
O gene SP foi expresso em meristema não induzido à floração (MAV) de
S.pimpinellifolium, o oposto foi visto em MT, onde os altos níveis foram
localizados no meristema reprodutivo (MAR) (Figura 9B).
O maior nível de expressão de S foi observado no MAR de MT, enquanto que em S.pimpinellifolium, os níveis elevados foram em meristema vegetativo (MAV) (Figura 9C).
Figura 9: Perfil de expressão de genes envolvidos na floração nos meristemas de Micro- Tom e S. pimpinellifolium. A, nível de expressão gênica de FALSIFLORA (FA) nos
meristemas apicais vegetativos (MAV) e reprodutivo (MAR) de Micro-Tom (MT) e
S.pimpinellifolium (SP). B, SELF-PRUNING (SP) e C, COMPOUND INFLORESCENCE (S).
A
B
Dos cDNAs identifcados nas bibliotecas subtrativas, alguns foram escolhidos como alvo para a caracterização de sua expressão. Assim, foram observados altos níveis de expressão do gene H2A nos meristemas apicais não induzidos (MAV) a floração de Micro-Tom (MT) e S. pimpinellifolium (SP) (Figura 10A), enquanto no gene Inibidor de Proteinase II, os níveis de expressão foram maiores nos meristemas apicais induzidos à floração (MAR) de MT e de SP (Figura 10B). Por outro lado, os níveis de expressão foram similares nos MAR e MAV na CYP51 e no polifenol oxidase (PPO) em MT e SP (Figura 10C e D, respectivamente).
Figura 10: Perfil de expressão gênica de cDNAs homólogos à H2A, Inibidor de Proteinase II, CYP51 e PPO encontrados nas bibliotecas subtrativas no meristema apical. Em A, nível
de expressão do gene H2A em meristema apical vegetativo (MAV) e meristema apical reprodutivo (MAR) de Micro-Tom (MT) e Solanum pimpinellifolium (SP). B, Inibidor de Proteinase II. C, Ciclofilina (CYP51). D, Polifenol oxidase, PPO.
A
B
C
Na expressão do gene desconhecido, 113585F, os altos níveis foram observados em MAV de MT e em MAR de SP (Figura 11A), enquanto que na proteína de choque térmico (Hsp20.2) estes níveis foram notados no MAR de SP e MT (Figura 11B). Em CAB, os níveis foram elevados em MAV de SP e de MT (Figura 11C).
Figura 11: Perfil de expressão gênica de cDNAs homólogos à 113585F, Hsp20.2 e CAB encontrados nas bibliotecas subtrativas no meristema apical. Em A, nível de expressão do
gene desconhecido 113585F em meristema apical vegetativo (MAV) e meristema apical reprodutivo (MAR) de Micro-Tom (MT) e Solanum pimpinellifolium (SP). B, Proteína de choque térmico (Hsp20.2). C, Clorofila a/b (Cab).
A
B
O cDNA homólogo à ciclofilina obtida previamente de uma biblioteca subtrativa participa de vários processos importantes no desenvolvimento da planta (ROMANO et al., 2004). Desta forma, foi realizada uma análise in silico para verificar a relação gênica desta sequência em diferentes espécies de plantas. Assim, foram realizadas buscas por sequências homólogas em bancos de dados conhecidos, algumas foram convertidas em sequências peptídicas, alinhadas e pesquisaram-se os domínios funcionais para cada sequência. Desta forma, foi identificado o domínio funcional Cyclophilin_ABH_like (Cyclophilin A, B and H-like cyclophilin-type peptidylprolyl cis- trans isomerase -
PPIase) que é uma enzima que acelera o enovelamento das proteínas,
catalisando isômeros cis-trans das ligações peptídicas precedidas de resíduos de prolina. A figura 12 mostra o domínio funcional da proteína CYP, o qual correspondente a superfamília das ciclofilinas que se encontra completo e presente em S. lycopersicum. Este resultado mostra que a sequência identificada anteriormente da biblioteca subtrativa encontra-se completa e com o domínio funcional característico.
Figura 12: Domínio funcional da proteína CYP em Solanum lycopersicum. O domínio
funcional Cyclophilin_ABH_like pertencente a superfamília de ciclofilina encontra-se completo e com um E-VALUE acima de 1 x 10-15 em tomateiro. Extraído do programa Conserved Domain
Database - CDD.
O dendograma da proteína LeCYP1 encontrado em S. lycopersicum foi realizado através do programa MEGA 5.0 (Figura 13) utilizando diferentes sequências homólogas encontradas nos bancos de dados. O dendograma gerado indicou separação entre as classes de mono e dicotiledôneas, porém um único representante de gimnosperma (Pinus teada) homólogo a CYP se dispersou na classe de dicotiledôneas. O pinheiro (Pinus teada) pertence à família Pinaceae de gimnosperma. Além disso, foi observado que cada ramificação do clado está agrupada em famílias. No ramo das monocotiledôneas (círculo azul, figura 13) está à família Poaceae (Triticum
Solanaceae (círculo vermelho, figura 13) que inclui a sequência LeCYP1 (Solanum lycopersicum), o pimentão (Capsicum annuum), a batata (S.
tuberosum), S. commersonii e S. sogarandinum. Entretanto, outras famílias de
dicotiledôneas também estão presentes no clado como Fabaceae (Medicago
trucatula), Convolvulaceae (Iponea batatas), Rutaceae (Citrus sinensis) e
Brassicaceae (Arabidopsis thaliana) (Figura 13).
Figura 13: Dendograma da proteína Cyp em Solanum lycopersicum e em outras espécies de plantas. O dendograma foi construído utilizando o método Neighbor-joining do programa
MEGA 5.0 e o software Tree-based Consistency Objective Function for alignment Evaluation (T-Coffee) foram usados para fazê-lo. O número abaixo das linhas são os valores de bootstrap em 500 replicadas. Em vermelho, a família Solanaceae. Em verde, A sequencia de ciclofilina em Solanum lycopersicum (Número de acesso: P21568.1); S.commerso, S. commersonii (AAB51386.1); S.tuberosu, S. tuberosum (TC199071); S.sogarand, S. sogarandinum (ABK34279.1). S.lycopers, Solanum lycopersicum (TC243758) e C.annuum, Capsicum annuum (ACB05668.1). I.batata, Iponea batatas (ABP35528.1). P.teada, Pinus teada (ABQ14358.1). Medicago, Medicago trucatula (TC159225). Csinens, Citrus sinensis (ACX37092.1). A.thaliana,
Arabidopsis thaliana (AT4G38740.1). Em azul, a família Poaceae. O.sativa indica a espécie Oryza sativa (LOC_Os02g02890.1); T.aestivum, Triticum aestivum (TC371042).
Outro cDNA de interesse para este trabalho apresentou homologia à proteína reprimida por auxina – ARP (auxin repressed protein). Então, foi realizada uma análise in silico para verificar a relação gênica desta sequência em diferentes espécies de plantas. Assim, foi encontrado o domínio
Auxin_repressed, proteína associada à dormência/auxina, em todas as
compreendida. Na figura 14, foi apresentado que este domínio funcional está completo e presente no tomateiro (S. lycopersicum).
Figura 14: Domínio funcional da proteína ARP em Solanum lycopersicum. O domínio
funcional pertencente à superfamília Auxin_repressed está completo e com um E-VALUE acima de 1 x 10-15 em tomateiro. Retirado do programa CDD.
No dendograma para a proteína ARP em S. lycopersicum, foi observado que em cada ramo as espécies estão agrupadas em famílias botânicas e a espécie externa (Picea sitchensis) pertencente à família Pinaceae de gimnosperma encontra-se na região basal do mesmo (Figura 15). O trigo (Triticum aestivum), o arroz (Oryza sativa) e o milho (Zea mays) pertencem à família Poaceae de monocotiledôneas (círculo azul, figura 15). A sequência ARP (S. lycopersicum) pertence à família Solanaceae que também inclui a batata (S. tuberosum) e o tabaco (Nicotiana tabacum) (círculo vermelho, figura 15). Além destes, há a família Fabaceae que abrange o amendoim (Arachis
hypogagea), a acácia falsa (Robinia pseudoacacia), a ervilha (Pisum sativum), Sesbania drummondii e Medicago trucatula; a família Brassicaceae
(Arabidopsis thaliana); Euphorbiaceae que compreende a mamona (Ricinus
communis), ao pinhão manso (Jatropha curcas) e a mandioca (Manihot esculenta); Campanulaceae (Codonopsis lanceolata) e Elaeagnaceae
(Elaeagnus umbellata) (Figura 15).
Outro ponto observado é que muitos ortólogos para a proteína ARP descritos na literatura foram observados neste dendograma como é o caso da
RpARP de Robinia pseudoacacia (PARK &HAN, 2003), Arpl1;1 de tabaco
(STEINER et al., 2003), PsDRM1 de ervilha (STAFSTROM et al., 1998) e
Figura 15: Dendograma da proteína ARP em plantas. O dendograma foi construído
utilizando o método Neighbor-joining do programa MEGA 5.0 e o software Tree-based
Consistency Objective Function for alignment Evaluation (T-Coffee) foram usados para fazê-lo.
O número abaixo das linhas são os valores de bootstrap em 500 replicadas. Em vermelho, a família Solanaceae. Em verde, a sequencia da Proteína Reprimida por Auxina em Solanum
lycopersicum (Número de acesso: ABH07900.1); S.tuberosu (1), Solanum tuberosum
(TC208714 e TC198912); N.tabacum, Nicotiana tabacum (AAS76635.1). S.lycopers, Solanum
lycopersicum (TC219584). C.lanceola, Codonopsis lanceolata (AAW02792.1). E.umbellat, Elaeagnus umbellata (AAC62104.2). P.sitchens, Picea sitchensis (ADE76976.1). R.communis, Ricinus communis (XP_002509446.1). J.curcas, Jatropha curcas (ADB02903.1). M.esculent, Manihot esculenta (AAX84677.1). A.thaliana. Arabidopsis thaliana (AT5G44300.1).
A.hypogaea, Arachis hypogagea (AAZ20292.1). P.sativum, Pisum sativum (AAB84193.1). M.trucatu, Medicago trucatula (TC176253). S.drummond, Sesbania drummondii (ABQ44282.1). R.pseudoac, Robinia pseudoacacia (AAG33924.1). Em vermelho, a família Poaceae. Z.mays,
Zea mays (TC544350). O.sativa, Oryza sativa (LOC_Os11g44810.1). T.aestivum Triticum aestivum (TC389737).
Com o intuito de caracterizar funcionalmente estes dois cDNAs, foi realizada a construção de cassetes de superexpressão para posterior transferência para plantas de S. lycopersicum cv Micro-Tom.
O cDNA homólogo a ciclofilina (CYP) foi isolado do plasmídeo pGEM T- easy (Promega) através das endonucleases de restrição SacII e SpeI, enquanto que o cDNA homólogo à proteína reprimida por auxina (ARP) foi
retirado pelas enzimas de restrição ApaI e SacI para a orientação senso e ApaI e SpeI para a orientação antissenso. A figura 16 mostra o tamanho dos fragmentos obtidos separados em gel de agarose e os quais estavam de acordo com os padrões de bandas esperadas. Portanto, para a CYP tem-se aproximadamente 514 pb do inserto e para a sequência de ARP 522 pb do inserto. Além disso, pode-se analisar o fragmento da sequência ARP para a orientação senso e antissenso (amostra 3 e 4 respectivamente, figura 16) a qual apresenta um padrão de bandas que corresponde ao tamanho do fragmento desejado que é aproximadamente 1300 pares de base (35S::ARP/S e 35S::ARP/AS), o que indica aproximadamente 522 pb do cDNA homólogo ao ARP com os 800 pb do promotor CaMV35S. Estes fragmentos foram liberados através das enzimas de restrição SacI e HindIII.
Figura 16: Perfil de migração eletroforética em gel de agarose e coloração com o brometo de etídeo. O tamanho dos fragmentos de restrição esperados estão de acordo com o
marcador 1Kb DNA Ladder (Fermentas) cujo pares de bases correspondentes as bandas estão apresentados na vertical. Amostras 1 e 7: Marcador 1Kb DNA Ladder. O fragmento de restrição
SacII-Cyp-SpeI (amostra 5) apresenta um tamanho de aproximadamente 500 pb (seta verde).
Assim como o fragmento de restrição ApaI-ARP-SacI (amostra 2) apresenta um tamanho de 500pb, e o fragmento SacI-ARP-CaMV35S-HindIII (amostra 3 e 4) na orientação antissenso e senso respectivamente, apresenta um tamanho de aproximadamente 1300 pb.
A construção dos cassetes de ARP nas orientações senso e antissenso foram introduzidas no vetor binário pZP211 e confirmada através de enzimas de restrição (SacI e HindIII) e pelo método de PCR, na qual pode-se observar na figura 17, o perfil de migração eletroforética dos fragmentos que
1 2 3 4 5 6 7 10000 8000 6000 5000 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250 10000 8000 6000 5000 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250 ARP CYP
correspondem a construção de ARP na orientação antissenso extraído através do método de minipreparação de plasmídeos e aplicado em uma reação de PCR com um iniciador específico para amplificar o cDNA homólogo a ARP que apresenta um tamanho de 300 pb, além da ARP ligado ao plasmídeo pGEM T- Easy como controle positivo e portanto, este fragmento foi amplificado (Amostra 14, Figura 17) e o plasmídio pZP211 como controle negativo, o qual o fragmento não foi amplificado por não ter o inserto (Amostra 18, Figura 17).
Figura 17: Perfil de migração eletroforética em gel de agarose e coloração com o brometo de etídeo dos fragmentos (ARP na orientação antissenso) obtidos pelo método de PCR. Este gel mostra o tamanho do fragmento esperado para o cDNA homólogo ao ARP
(amostra 9, retângulo vermelho) que é correspondente a 300pb de acordo com o marcador 1Kb DNA Ladder (Fermentas) cujo pares de bases correspondentes as bandas estão apresentados na vertical. Amostras 1: Marcador 1Kb DNA Ladder. Amostra 2- 13: fragmentos de DNA para a construção do cassete de superexpressão de ARP na orientação antissenso. Amostras 14: ARP no vetor pGEM T-Easy (controle positivo); Amostra 18: plasmídio pZP211 (controle negativo).
Com uma abordagem semelhante, a construção do cassete de superexpressão do cDNA homólogo a ARP na orientação senso foi obtida. Neste caso, foi realizada uma extração do cassete de superexpressão na orientação senso através do método de minipreparação de plasmídeos após a transformação em Agrobacterium tumefaciens e posteriormente, estas amostras foram aplicadas em uma reação de PCR. Na figura 18, pode-se notar a amplificação dos fragmentos de 300 pb que correspondem à ARP (Amostras 4, 5, 9, 11 e 12) pelo método de PCR, ao contrário do controle negativo, a
Agrobacterium tumefaciens com o vetor binário pZP211 ausente não
apresentou amplificação (Amostra 13).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
500pb 250pb
Figura 18: Perfil de migração eletroforética em gel de agarose e coloração com o brometo de etídeo dos fragmentos (ARP na orientação senso) obtidos pelo método de PCR. Este gel mostra o tamanho do fragmento esperado para o cDNA homólogo ao ARP
(amostras 4, 5, 9, 11 e 12, retângulo vermelho) que é correspondente a 300pb de acordo com o marcador 1Kb DNA Ladder (Fermentas) cujo pares de bases correspondentes as bandas estão apresentados na vertical. Amostra 1: Marcador 1Kb DNA Ladder. Amostras 2- 12: fragmentos de DNA para a construção do cassete de superexpressão de ARP na orientação senso. Amostras 13: Agrobacterium tumefaciens com o vetor binario pZP211 ausente (controle negativo).
Estes resultados confirmam a obtenção dos cassetes de superexpressão da ARP na orientação senso e antissenso. A figura 19 corresponde a um esquema representativo do vetor binário pZP211 vazio (Figura 19A) e da construção dos cassetes de superexpressão nas orientações senso (Figura 19B) e antissenso (Figura 19C).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
500pb 250pb
Figura 19: Representação esquemática do vetor binário pZP211 e das construções dos cassetes de superexpressão contendo a sequencia de cDNA ARP. O vetor binário pZP221
(9012 pb) é mostrado em A. Em B, a construção do cassete de superexpressão do cDNA homólogo a ARP (seta marrom) na orientação senso e em C, a orientação antissenso. RB, borda direita. LB, borda esquerda. LacZ, gene da - galactosidase F (283 pb). 35S, promotor CaMV35S (800 pb). nptII, neomicina fosfotransferase II (800 pb). PolyAAA, sitio de poliadelinação do vetor pZP211 (191 pb).HindIII-EcoRI, enzimas de restrição (triângulo).
Após a confirmação dos cassetes de superexpressão, os plasmídeos pZP211 contendo o cDNA homólogo a ARP nas orientações senso e
B
RB LB
35S ARP LacZ 35S nptIIi PolyAAA
H in d III Ba m H I S p e I N o tI E a g I S a c II S a c I E c o RI C H in d III Ba m H I S p e I N o tI E a g I S a c II S a c I E c o RI RB
35S ARP LacZ 35S nptIIi PolyAAA
LB A H in d III S p h I P st I S a lI X b a I Ba m H I S m a I K p n I S a c I E c o RI RB LB
LacZ 35S nptII PolyAAA 800 pb 1083 pb 191 pb 1083 pb 1083 pb 800 pb 800 pb 191 pb 191 pb 800 pb 522 pb 1322 pb 522 pb 800 pb 1322 pb
antissenso foram transferidos para Agrobacterium tumefaciens LBA4404 e posteriormente, em plantas S. lycopersicum cv. Micro-Tom e MT-Rg1 através de protocolo utilizando os discos cotiledonares. As plantas MT-Rg1 possuem alta capacidade de regeneração (PINO et al., 2010). As plantas cv. MT e MT- Rg1 regeneradas (T0) em cultura in vitro foram transferida para solo e aclimadas em casa de vegetação para posterior análise fenotípica.
Em adição, foi realizado tratamento com as plantas de S. lycopersicum cv. MT e o mutante dgt (diageotropica). Foi observado que o gene DGT codifica a LeCYP1 que participa da sinalização por auxina e a droga imunossupressora ciclosporina A (CsA) inibe esta ciclofilina e consequentemente inibe a resposta à auxina. O mutante dgt demonstra fenótipos pleiotrópicos como ausência de raízes laterais, redução da dominância apical e crescimento do fruto, diminuição da resposta ao gravitropismo e alterações no desenvolvimento vascular (OH et al., 2006). Estes fenótipos normalmente são característicos da ação das auxinas. Então, com intuito de verificar se o desenvolvimento das raízes laterais também seriam alterados pelas diferentes concentrações de auxina exógena (NAA) e CsA e também se os níveis de expressão de LeCYP1