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A partir da análise visual das plântulas tratadas, foi possível constatar que há um inibição do crescimento e o escurecimento das raízes em ambas as espécies tratadas com 3-AT (Figura 6). O decréscimo no tamanho das raízes foi relatado por Ali e Fletcher (1978); Hilton (1969). Posteriormente, Heim e Larrinua (1989) concluíram que o 3-AT não provoca variações significantes no conteúdo de clorofilas, porém inibe a elongação da raiz. De maneira similar, também foram evidenciados neste estudo a inibição da elongação das raízes e a ausência de danos foliares aparentes. Observou-se que ocorrem poucas variações no conteúdo de clorofila total entre as plantas tratadas e controle no mesmo estágio de desenvolvimento (Figura 7). Desta forma, o tratamento com 3-AT não parece influenciar diretamente na síntese de clorofila.

A redução na produção de raízes laterais durante o estabelecimento das plântulas pode estar relacionada ao mau funcionamento dos peroxissomos, como demonstrado em Arabidopsis (Zolman et al., 2005). Tal perturbação pode ser resultado do tratamento com o 3-AT, que provoca uma drástica redução na atividade total da Catalase (Figura 9), uma das enzimas mais abundantes em frações proteicas do glioxissomo/peroxissomo, podendo corresponder a 6% do total de proteínas presentes no peroxissomo (Eising, Trelease e Ni, 1990; Yanik e Donaldson, 2005).

O mecanismo de inibição da Catalase pelo 3-AT foi detalhadamente demonstrado por Putnam et al. (2000) utilizando como modelo a catalase de eritrócitos humanos. O processo de inibição ocorre mediante reação irreversível do 3-AT com um resíduo de histidina localizado próximo grupamento heme, sendo a reação dependente da doação de dois elétrons que são, provavelmente, fornecidos pelo H2O2. Atualmente, apenas os efeitos da inibição da Catalase têm sido

demonstrados em vegetais, como nos estudos realizados por Gechev et al. (2002, 2008); Lima (2007); Qureshi et al. (2010); Shao et al. (2008); Silva (2010), bem como no presente estudo.

Esperava-se que a inibição da CAT permitisse o aumento no conteúdo de H2O2

observado apenas nos tempos iniciais de tratamento, entre 6 e 12 horas para o cártamo e apenas com 6 horas para o girassol (Figura 11). Ainda assim, nestes tempos o conteúdo de MDA não foi elevado, indicando que provavelmente não ocorreu um aumento da peroxidação de lipídeos. O aumento no conteúdo de MDA foi verificado nas plantas de cártamo após 24 horas de tratamento. No entanto, os níveis de H2O2 permaneceram similares aos do controle, portanto, é provável que o

aumento da peroxidação de lipídeos não seja provocado pelo acúmulo de H2O2

como proposto por Wang et al. (2009), e sim por outras EROs, principalmente as relacionadas ao estresse causado por alta luminosidade, visto que, a planta está iniciando a atividade fotossintética (Baroli et al., 2004; Gill e Tuteja, 2010), o mesmo fato foi observado para o girassol com 48 horas de tratamento. Apesar do aumento na peroxidação dos lipídeos, não podemos determinar quais os lipídeos estão originando o MDA, ou se também estão ocorrendo danos a outras biomoléculas como as proteínas.

Durante o estabelecimento das plântulas de cártamo foi observada uma redução progressiva do conteúdo de proteínas solúveis totais (Figura 8). Este decréscimo, associado ao aumento das atividades da APX (Figura 9) e da SOD (Figura 10), indica que as enzimas antioxidantes apresentam um aumento da sua representatividade dentro do conjunto total de proteínas do vegetal. Este evento demonstra a importância do sistema antioxidante enzimático neste estágio do desenvolvimento. Por outro lado, para o controle das plantas de girassol esta representatividade é maior às 24 horas, decaindo com 48 horas, e o inverso é visualizado para as plantas tratadas. Ainda assim, observa-se que o sistema antioxidante da SOD parece ser de extrema importância para o estabelecimento pós-germinativo.

A atividade total da APX respondeu de forma diferente nas duas espécies (Figura 9). No cártamo, ela apresenta-se correlacionada ao conteúdo de clorofilas totais de forma independente ao tratamento (Figura 7). Em 48 horas, foi possível visualizar um aumento significativo na atividade da APX nas plantas tratadas, indicando que o sistema antioxidante da APX parece ser influenciado pelo tempo de desenvolvimento da plântula e pela deficiência no sistema da CAT. A influência de um sistema antioxidante em outro está vinculada a resposta de aclimatação,

56 principalmente em situações onde há um aumento da concentração das EROs (Bonifacio et al., 2011; Ishikawa et al., 2005; Mittler, Feng e Cohen, 1998; Rosa et al., 2010). Portanto, a inibição pontual da CAT realizada neste estudo indica que há uma influência positiva deste sistema sobre a atividade total da APX, principalmente nas plantas com CAT inibida, como já demonstrado por Gechev et al. (2002); Lima (2007); Silva (2010). Tradicionalmente, relata-se que CAT possui um papel fundamental no estabelecimento da plântula catabolizando o H2O2 produzido durante

a β-oxidação e fotorrespiração (Gonzalez e Vodkin, 2007). Porém, neste caso há indicações da importância do sistema antioxidante da APX, provavelmente devido ao catabolismo do H2O2 que extravasa do glioxissomo, principalmente durante fase final

do estabelecimento (Graham, 2008).

A atividade total da APX nas plantas de girassol tratadas decai, porém verifica-se um aumento progressivo da atividade média da APX em função do tempo, retornando ao nível do controle com 48 horas (Figura 7). Este comportamento pode indicar que a resposta enzimática da APX é lenta no girassol. Logo, é provável que, de forma similar a diversas espécies, o girassol possua outros mecanismos de caráter não enzimático que mantenham a homeostase redox durante este período inicial do estabelecimento (Arbona et al., 2003; Foyer e Noctor, 2005, 2009; Pourcel et al., 2007, p. 200; Shao et al., 2007; Skłodowska et al., 2009). Vale ressaltar que a isoforma citosólica da APX está mais representada nesta quantificação.

O sistema antioxidante da SOD respondeu de forma similar em ambas as espécies, principalmente com 48 horas (Figura 10). Associado a isto, as plantas de girassol tratadas apresentaram aumento na peroxidação de lipídeos e manutenção do conteúdo de H2O2 (Figura 11). Considerando que entre 24 e 48 horas o conteúdo

de clorofilas duplica, tais danos oxidativos podem ser decorrentes do aumento da atividade dos fotossistemas, que são um dos principais sítios de produção do superóxido em vegetais (Gill e Tuteja, 2010). Por conseguinte, o controle da produção e do consumo do superóxido pode ser extremamente importante para a manutenção da homeostase redox durante o estabelecimento fotossintético em plântulas de girassol. No entanto, não estão descartados os metabolismos mitocondrial e peroxissomal como geradores e consumidores de superóxido, já que

eles também possuem cadeias transportadoras de elétrons e pelo menos uma das isoformas da SOD (Giannopolitis e Ries, 1977; Gill e Tuteja, 2010; Río e Donaldson, 1995; Zhu e Scandalios, 1994). Além disto, não é possível afirmar se os danos oxidativos são um efeito direto da ação do superóxido ou reflexo da ionização do H2O2 em íon e radical hidroxila uma vez que, a SOD tem como produto final de

reação o H2O2.

O aumento da expressão da Mn-SOD promove melhorias no estabelecimento pós-germinativo (Xi et al., 2010), associado a isto, relata-se um incremento na atividade da SOD em plantas submetidas a condições de alta luminosidade ou expostas a diferentes tipos de luz (Haghjou, Shariati e Smirnoff, 2009; Robert et al., 2009; Santini et al., 2012). Por outro lado, o aumento da produção de superóxido ocasiona a dificuldade de germinar normalmente (Roqueiro et al., 2012). Além disso, também já foi demonstrado que sementes armazenadas em alta pressão parcial de O2 apresentam um decréscimo significativo da capacidade germinativa (Groot et al.,

2012). Neste estudo, as plantas de girassol tratadas apresentam uma correlação forte entre o conteúdo de clorofilas totais, a atividade de SOD e o tempo de tratamento (Figura 12). No entanto, a elevação no nível de MDA (Figura 11) indica que, mesmo com o aumento da atividade da SOD, a planta ainda está sob condição de estresse. Esses fatos podem indicar que a regulação dos níveis de superóxido, realizada pelo sistema antioxidante da SOD, é extremamente importante para a manutenção da homeostase redox durante o amadurecimento fotossintético, principalmente em situações de estresse oxidativo, embora ainda ocorram danos oxidativos quando há uma inibição da CAT.

As plantas de cártamo apresentam uma clara correlação entre o conteúdo de clorofilas e a atividade da SOD ou atividade da APX (Figura 13), mas tal fato ocorre de forma independente ao tratamento. Lee et al. (2010); Sun et al. (2010) demonstraram que o aumento da expressão de SOD e APX pode melhorar a germinação e o desenvolvimento do vegetal diante de algumas condições de estresse. Logo, o aumento na atividade de APX e da SOD no cártamo, provavelmente, está suportando o estabelecimento fotossintético da planta nesta condição de estresse, enquanto que para o girassol a atividade de SOD é majoritária nesta função. Desta forma, o decréscimo dos níveis de H2O2 e MDA (Figura 11) nas

58 plantas de cártamo com 48 horas pode ser um reflexo desta parceria. Sendo assim, diante da menor atividade da CAT, os sistemas antioxidantes da APX e da SOD são essenciais para o estabelecimento fotossintético das plantas de cártamo, principalmente em condições de estresse.

A sinalização promovida pela produção de EROs é bem primitiva na escala evolutiva dos seres aeróbios (Mittler et al., 2011). O aumento dos níveis de EROs podem regular a expressão de diversos genes relacionados a aclimatação do vegetal a condições ambientais (Desikan et al., 2001), em geral, estes genes estão inseridos em redes de resposta a estímulos e na regulação de processos biológicos (Suzuki et al., 2011). O superóxido e o H2O2, participam ativamente do processo de

sinalização, migrando de uma organela para outra, no caso do H2O2, ou oxidando

lipídeos e proteínas que irão participar de outras cascatas de sinalização (Desikan et al., 2001; Mittler et al., 2011).

A produção do superóxido é influenciada pela fotofosforilação (cloroplasto), ciclo do ácido cítrico (mitocôndria) e β-oxidação e ciclo do glioxilato (glioxissomo). O primeiro promove o aumento da relação NADPH/NADP+ _{e os três últimos da relação}

NADH/NAD+_{, incrementando o fluxo das cadeias transportadoras de elétrons das}

respectivas organelas, o que pode provocar aumento do escape elétrons para o oxigênio formando o superóxido (Gill e Tuteja, 2010; Nyathi e Baker, 2006). Enzimas denominadas de Oxidases Homólogas da Explosão Respiratória (Respiratory Burst Oxidase Homolog – RBOH) são consideradas elementos chave da sinalização promovida por EROs em plantas (Mittler and others 2011; Suzuki and others 2011). Estas enzimas também incrementam a produção de superóxido, principalmente devido ao aumento na atividade do complexo da NADPH-oxidase, que faz parte deste grupo. Portanto, a condição fotossintetizante inicial possui condições para promover o aumento da produção de EROs e gerar explosões oxidativas que podem resultar em ondas de sinalização, nas quais o superóxido pode possuir um papel fundamental.

A deficiência no sistema antioxidante da CAT também modificou o padrão de expressão dos genes da MLS, ICL, cAPX e da própria CAT. No entanto, a resposta entre as espécies foi parcialmente diferente. No cártamo, a expressão relativa da CAT tende aumentar nas plântulas tratadas (Figura 16), enquanto que no girassol o

padrão de expressão é inverso, com o decréscimo rápido no nível de transcrição (Figura 15), quando comparamos às plantas controle com o mesmo tempo de desenvolvimento. O comportamento de aumento e decréscimo é correlacionado com a maior atividade da β-oxidação e da fotorrespiração, e já foi visualizado durante o estabelecimento de plântulas de soja na etapa de transição funcional metabólica (Gonzalez e Vodkin, 2007). O presente estudo demonstrou que ocorre um rápido decréscimo da expressão da CAT nas plantas de girassol tratadas (Figura 15), estando este provavelmente relacionado a aceleração da transição metabólica nesta condição de estresse. Desta forma, é provável que H2O2 gerado pela vias da

β-oxidação, fotorrespiração e pela reação da SOD não seja catabolizado pela CAT, mas sim por outros antioxidantes. Por outro lado, o cártamo apresentou uma tendência de aumento na atividade e na expressão da CAT das plantas tratadas com 3-AT (Figura 16). Quando se observa a atividade (Figura 9) e a expressão (Figura 16) da CAT em cártamo, verifica-se um aumento de duas vezes na expressão e na atividade de CAT entre os tempos de 12 e 48 horas, isto pode indicar que, mesmo com uma baixa eficiência promovida pela inibição, o sistema da CAT ainda é importante durante o estabelecimento das plântulas de cártamo. Além disso, quando observavos a escala do consumo de H2O2 da CAT do cártamo e do girassol,

verificamos que a capacidade de degradação do cártamo é cerca de 2 vezes maior que a apresentada pelo girassol.

Gonzalez e Vodkin (2007) também demonstraram que em plântulas de soja a expressão da APX2 (AAB01221.1) mantém-se elevada até o auge do estágio de transição, decaindo rapidamente após a transição entrar na fase final. O mesmo comportamento pode se visualizado para a expressão da cAPX em girassol (Figura 15), que decai com 12 nas plantas controle, enquanto que nas plântulas tratadas isto ocorre apenas com 48 horas. Este fato pode indicar um retardo na resposta da cAPX, porém também pode estar vinculado ao aporte de um maior número de enzimas para assegurar a viabilidade da planta posteriormente, visto que, alguns mRNAs codificantes para enzimas dos sistemas antioxidantes podem permanecer no citoplasma ou núcleo por longos períodos quando ligados a Proteínas de Ligação a RNA – RBPs (Heintzen et al., 1997; Kim et al., 2007; Lorković, 2009). Desta forma, é provável que em situações onde há uma menor atividade e expressão de CAT,

60 ocorra um aumento da expressão dos transcritos da cAPX, e este incremento é tardia e lentamente visualizado no perfil de atividade (Figura 9). No entanto, considerando que o transcrito de APX avaliado não reflete o padrão de todos os outros, há de admitir-se que novos estudos são necessários para caracterizar as isoformas e transcritos de APX em girassol e cártamo já que, existem relatos de expressão diferencial de transcritos de APX quando há o nocaute de algumas das isoformas desta enzima (Bonifacio et al., 2011; Lazzarotto et al., 2011; Rosa et al., 2010).

As plântulas de cártamo apresentam um aumento na atividade e expressão da cAPX, com destaque para as plântulas tratadas. Não obstante, visualiza-se o máximo de expressão nas plantas tratadas com 6 horas (Figura 15). Isto reforça a hipótese do aumento posterior da atividade mediante o aporte de transcritos produzidos horas antes, pois se constata um incremento considerável da atividade da APX nos tempos subsequentes, principalmente em condições de estresse (Figura 9).

Após a visualização dos efeitos que a inibição da CAT provocou nos parâmetros morfológicos, bioquímicos e moleculares relacionados aos sistemas antioxidantes, o presente estudo verificou que ambas as espécies apresentaram variações na expressão relativa das enzimas marcadoras do ciclo do glioxilato, confirmando parcialmente uma das hipóteses.

Normalmente, é observada uma tendência ao decréscimo da expressão de ICL e MLS com o decorrer do tempo, até atingir níveis indetectáveis (Rylott, Hooks e Graham, 2001), e de fato ocorreu um comportamento similar nas plantas controle. Porém, quando a CAT está inibida observa-se um aumento significativo na expressão da MLS e da ICL com 6 horas, seguido de um rápido decréscimo nos tempos subsequentes (Figura 16). Seguindo a linha de argumentação proposta por Anand et al. (2009), este fato pode ser explicado se considerarmos que a MLS é extremamente sensível a altas concentrações de H2O2, que também foram

visualizadas neste estudo. Portanto, tal aumento no número de transcritos estaria repondo a perda de enzimas provocada pelo processo de carbonilação.

A expressão da ICL nas plântulas de girassol tratadas apresenta resposta similar a da MLS. Porém, este fato pode estar relacionado a aceleração da produção

do Glioxilato (produto da reação da ICL), uma vez que, o H2O2 pode reagir

espontaneamente com o glioxilato (Yanik e Donaldson, 2005), e isto poderia impedir que o glioxilato seja aproveitado pela MLS para realizar a síntese do malato. Ainda assim, o rápido aumento seguido de um acentuado decréscimo na expressão da ICL e da MLS nas plantas de girassol tratadas, pode indicar uma aceleração nas vias do ciclo do glioxilato e consequentemente da mobilização das reservas.

A associação da expressão da ICL e da MLS com o Conteúdo de Clorofila, determinou uma alta correlação para as plantas tratadas (Figura 17), enquanto as plantas controle apresentaram menor índice de correlação. Tal fato pode indicar que, na deficiência do sistema antioxidante da CAT há uma tendência de aceleração ao estabelecimento fotossintético da planta.

Em teoria, efeitos similares aos ocorridos no girassol deveriam ser observados para as plântulas de cártamo, mas de forma inesperada a expressão da MLS decai rapidamente nas plantas controle e tratadas, sendo indetectável após às 12 horas (Figura 16). Contudo, a resposta da ICL é parcialmente similar a visualizada no girassol, ocorrendo um aumento nos tempos iniciais (6 e 12 horas), seguida de uma indicação ao decréscimo com 48 horas (Figura 16). Esta diferença entre as espécies pode ser resultante da maior atividade total da APX constatada nas plântulas de cártamo, principalmente a partir das 24 horas (Figura 9), que possivelmente promove a redução do conteúdo de H2O2 (Figura 11), amenizando a situação de estresse

oxidativo. Em consequência, a expressão da ICL retorna aos níveis do controle após às 24 horas (Figura 16).

A aceleração do ciclo do glioxilato pode estar relacionada ao balanço entre NAD oxidado e reduzido. Alberty (2006) demonstrou que ocorrem diferenças nas cinéticas de reação do ciclo em situações oxidantes ([NAD+_{] = 1000[NADH]) e em}

condições redutoras ([NAD+_{] = 10[NADH]). Quando [NAD}+_{] = 1000[NADH] ocorre um}

rápido consumo do glioxilato e do acetil-CoA, provocando o aumento da concentração do malato e da Coenzima A livre em um curto espaço de tempo. A elevada concentração de malato permite que a segunda fase do ciclo ocorra, e mais uma molécula de acetil-CoA é consumida, resultando no aumento da concentração do succinato em um maior espaço de tempo. No entanto, quando [NAD+_{] =}

62 a síntese do succinato ocorre lentamente. Desta forma, a aceleração do ciclo promoveria o aumento da síntese de NADH no glioxissomo e o maior efluxo de succinato e malato para o ciclo do ácido cítrico, aumentando a quantidade de NADH na mitocôndria. O maior aporte de NADH poderia ser utilizado para reduzir antioxidantes não enzimáticos como ascorbato, auxiliando na manutenção da homeostase redox (Karyotou e Donaldson, 2005), principalmente quando a CAT está inibida. Nas etapas finais do desenvolvimento, a produção de coenzimas reduzidas seria assumido pela fotossíntese, provocando o rápido decréscimo da atividade do ciclo.

Diante do exposto, foi visto que na ausência do sistema antioxidante da CAT, há uma tendência de aumento na transcrição das enzimas marcadoras do ciclo do glioxilato e em seguida, sucede-se um rápido decréscimo. Contento e Bassham (2010) reportaram que o estabelecimento de plantas de Arabidopsis é favorecido mediante o aumento da atividade da Catalase em plantas cultivadas em meio sem sacarose, um dos drenos para o ciclo do glioxilato. Porém, ainda não há relatos da influência do sistema antioxidante da CAT em via anapleróticas, como o ciclo do glioxilato. Os resultados deste estudo indicam que, possivelmente, está ocorrendo uma aceleração no estabelecimento fotossintético do vegetal na deficiência do sistema da CAT, e tal fato ainda não possui precedentes na literatura.

O glioxissomo/peroxissomo é uma das organelas de grande importância durante a transição funcional da plântula, porque dentro dele estão sitiadas as enzimas MLS, ICL, CAT e pelo menos uma das isoformas de SOD (Gill e Tuteja, 2010; Graham, 2008; Hu et al., 2012; Mhamdi, Noctor e Baker, 2012). Além disso, aderida a sua face externa encontra-se uma isoforma de APX (Graham, 2008). As enzimas peroxissomais estão submetidas a variações dos níveis de EROs (Hu et al., 2012; Mhamdi, Noctor e Baker, 2012), principalmente de H2O2 e superóxido, visto

que, neste estágio a organela é o sitio de ocorrência da β-oxidação e do início da fotorrespiração, dois processos geradores de EROs e além disso, também ocorre a reoxidação do NADH que pode levar a produção de superóxido (Graham, 2008; Río e Donaldson, 1995; Sandalio, Palma e Rio, 1987). Diante deste cenário metabólico, este estudo indicou que a ausência de uma enzima antioxidante consumidora de H2O2, como a CAT, possui influência nas demais vias antioxidantes e nas vias

relacionadas a mobilização de reservas. Isto posto, caracterizamos o padrão de resposta de duas espécies da mesma família taxonômica e verificamos que, há sinais de conservação da resposta em nível transcricional, porém estes padrões são fortemente influenciados pelos demais fatores bioquímicos, caracterizando uma resposta espécie-específica. Desta forma, foi estruturado um modelo de vias metabólicas integradas (Figura 18) que resume as vias com maior importância para manter a homeostase redox durante o estabelecimento fotossintético. Este modelo apresenta as relações metabólicas comuns e diferente para as espécies estudadas e além disso, fornece novos alvos de estudo para pesquisas futuras.

A luz é o fator ambiental essencial à sobrevivência das plantas, a partir de sua influência foram moldadas as respostas moleculares, fisiológica e morfológicas. A emergência da semente é um evento único na vida do vegetal, é o primeiro contato direto com os sinais vitais para garantir o crescimento vegetativo das plantas. Durante a germinação ocorrem eventos metabólicos ainda não caracterizados, e muitos deles contam com a participação essencial das EROs. Ainda há pouco suporte na literatura sobre os eventos que promovem a germinação e o estabelecimento da planta, no entanto, relata-se a renovação total do sistema