O DNA total de P. elgii, AC13MS/D (P. ourofinensis), Paenibacillus sp. e B. subtillis foi extraído pelo kit MOBIO. As preparações de DNA foram amplificadas com os conjuntos de oligonucleotídeos 1406F/23SR; F72F/L1R e 1406F/L1R e o produto analisado por eletroforese em gel de agarose 1%. Os produtos amplificados passaram por eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 6%, o gel foi corado com nitrato de prata (Figura 40) e foi observado um maior polimorfismo de bandas para o conjunto de oligonucleotideos 1406F/23SR, então este foi escolhido para as comparações entre os micro-organismos.
121 Figura 40. Análise do Espaço Ribossomal Intergênico em gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. (ordem no gel: 1)Marcador Ladder 1 kb, 2) P. elgii 1, 3) P. elgii 2, 4) AC13MS/D (P. ourofinensis) 1, 5) AC13MS/D (P. ourofinensis) 2 – oligonucleotideos 1406F/23SR; 6) P. elgii 1, 7) AC13MS/D (P. ourofinensis) 1 – oligonucleotideos F72F/L1R; 8) P. elgii 1, 9) AC13MS/D (P. ourofinensis) 1 – oligonucleotideos 1406F/L1R; 10) Marcador Ladder 1 kb.
O resultado da amplificação do DNA total das cepas bacterianas com os oligonucleotideos 1406F/23SR está apresentado na Figura 41. Pôde ser observado, em duplicata, fragmentos de mesmo tamanho de produto para P. elgii, AC13MS/D (P. ourofinensis) e Paenibacillus sp. e um tamanho de fragmento diferente para o produto amplificado de B. subtillis. No gel de poliacrilamida (Figura 42) as amostras também estão em duplicata para confirmar a reproducibilidade dos resultados, além do fato da amplificação e RISA terem sido feitas com três repetições. P. elgii apresenta um padrão de bandas bem diferente de P. ourofinensis, apesar de existirem algumas bandas equivalentes. AC13MS/D (P. ourofinensis) e Paenibacillus sp. apresentaram um padrão de bandas bem semelhante, com poucas bandas diferentes. Pôde ser observado que o padrão de bandas do gênero Paenibacillus é totalmente diferente do padrão de bandas de Bacillus.
122 Figura 41. Eletroforese em gel de agarose do DNA amplificado por PCR com os oligonucleotídeos 1406F/23SR. M) Marcador Ladder 1kb plus; Pe) P. elgii; Po) AC13MS/D (P. ourofinensis); Psp) Paenibacillus sp.; Bs) Bacillus subtillis.
Figura 42. Análise do Espaço Ribossomal Intergênico em gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. 1) Marcador Ladder 1kb plus; 2 e 3) P. elgii; 4 e 5) AC13MS/D (P. ourofinensis); 6 e 7) Paenibacillus sp.; 8 e 9) Bacillus subtillis, 10 e 11) Marcador Ladder 1kb plus.
123 Diferenças também foram observadas nas análises por RAPD, comparando P. elgii, AC13MS/D (P. ourofinensis), Paenibacillus sp. e B. subtillis (Figura 43). Observou-se mais uma vez que o perfil de bandas do DNA de B. subtillis é totalmente diferente dos demais. No caso de Paenibacillus sp. o perfil é diferente, porém são observadas algumas bandas em comum com os demais perfis de banda de Paenibacillus, sendo que existe banda comum para P. elgii e Paenibacillus sp. que está ausente no perfil de AC13MS/D (P. ourofinensis). Ao comparar o perfil de bandas P. elgii e P. ourofinensis observou-se ausência de bandas em uma amostra e presença em outra bem como diferenças na intensidade de algumas bandas, porém o perfil de bandas dessas duas cepas é bastante semelhante entre si, existindo várias bandas em comum.
Figura 43. Eletroforese em gel de agarose 1%, em duplicata, do produto da reação de amplificação por RAPD com o primer 208. (M=marcador Ladder 1kb plus; Pe = P. elgii; Po = AC13MS/D (P. ourofinensis); Psp = Paenibacillus sp. e Bs = B. subtillis).
124 O resultado do sequenciamento do gene rpoB mostrou 98% de identidade de sequências entre P. elgii e AC13MS/D (P. ourofinensis) ao comparar a sequência obtida de P. elgii com dados do banco de sequências não redundantes do National Center for Biotechnology Information (NCBI) por meio do Nucleotide BLAST (Altschul et al., 1990) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). A sequência parcial do gene rpoB de P. elgii foi depositada no GenBank e o número de acesso é FJ407093. A árvore filogenética baseada nas sequências do gene rpoB mostra extrema proximidade entre P. elgii e AC13MS/D (P. ourofinensis) (Figura 44).
Os DNAs totais extraídos das cepas AC13MS/D (P. ourofinensis) e P. elgii LMG 24465 foram seqüenciados por meio do GS FLX Titanium (454 Life Science’s). Ferramentas de bioinformática foram utilizadas para montagem do genoma das duas cepas. O tamanho do genoma de AC13MS/D (P. ourofinensis) é de 7.812.260 pares de bases e o tamanho do genoma de P. elgii LMG 24465 é de 7.619.087 pares de bases, ou seja, as duas cepas possuem genomas de tamanhos diferentes.
125 Figura 44. Cladograma, das sequências do gene rpoB, obtido por meio do programa MEGA 4 utilizando Neighbor Joining – p-distance. Bootstrap=1000.
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5. Discussão
O presente trabalho concluiu o teste de estabilidade temporal para atividade antimicrobiana do sobrenadante da cultura do novo isolado AC13MS/D (P. ourofinensis) (Figuras 34, 35 e 36), dando prosseguimento ao trabalho de Kurokawa (2006). Esse experimento de teste da estabilidade do sobrenadante da cultura do novo isolado bacteriano AC13MS/D (P. ourofinensis) propõe a utilização do sobrenadante no controle de infecções veterinárias e como promotor de crescimento de animais. Os sobrenadantes da cultura, recuperados do isolado cultivado em meio de cultivo LB e em meio de cultivo peptona de soja e cloreto de sódio, foram mantidos à temperatura ambiente por um período de 100 dias. O sobrenadante da cultura em meio LB foi realizado como controle já que este meio de cultura é um meio rico bastante aplicado em estudos microbiológicos para o crescimento de bactérias. Outro controle utilizado foi manter o sobrenadante dos dois meios de cultura congelados sob a temperatura de - 20ºC e foi observado que o congelamento dos sobrenadantes conserva mais a atividade antimicrobiana do que manter os sobrenadantes à temperatura ambiente, porém o maior interesse para a indústria seria o sobrenadante mantido à temperatura ambiente. O meio baseado em peptona de soja com cloreto de sódio foi utilizado pois seria mais próximo do substrato que seria utilizado pela indústria para aplicar a atividade antimicrobiana do sobrenadante no controle das infecções. Foi observado que o sobrenadante do isolado cultivado em meio contendo peptona de soja e cloreto de sódio, mantido à temperatura ambiente, não formou mais halo de inibição na presença de B. subtillis após 84 dias de armazenamento (Figura 36). Com este resultado conclui-se que, em torno de aproximadamente 80 dias, o sobrenadante pode ser aplicado para fins de atividade antimicrobiana. Sendo assim, este extrato bacteriano e/ou sobrenadante de sua cultura poderá substituir promotores de crescimento atualmente utilizados na criação de diversos animais economicamente importantes, tais como frangos e porcos, pois possui habilidade de eliminar o crescimento de bactérias e fungos causadores de infecções veterinárias, inclusive cepas resistentes a antibióticos convencionais.
Atividades antimicrobianas também foram observadas em outras espécies do gênero Paenibacillus. P. polimixya apresenta atividade antifúngica, P. alvei apresenta atividade antimicrobiana contra patógenos Gram-negativos e também foi encontrada atividade antimicrobiana em P. elgii (Beatty and Jensen, 2002; Raza et al., 2008;
127 Anandaraj et al., 2009; Wu et al., 2010). Nesses estudos foi mostrado que peptídeos são responsáveis pela atividade antimicrobiana e as sequências peptídicas foram analisadas. O grupo Ourofino Agronegócio também vem pesquisando sobre o peptídeo responsável pela atividade antimicrobiana da cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) e a cadeia de aminoácidos que formam o peptídeo já foi elucidada (dados não mostrados).
Bibliotecas genômicas de AC13MS/D foram construídas após a verificação da atividade antimicrobiana, com a finalidade de buscar genes de interesse biotecnológico. As bibliotecas genômicas de AC13MS/D (P. ourofinensis) contém clones que portam fragmentos de DNA que são representantes de todas as regiões do genoma desse organismo. Nessas bibliotecas podem ser encontrados genes completos para síntese de antibióticos, enzimas, dentre outros. Porém ainda não foram obtidos resultados positivos para os clones de pequenos e grandes insertos. Entretanto, a busca pelo clone que contenha inserto contendo genes importantes biotecnologicamente deve continuar em outros trabalhos. Existem reportados vários trabalhos de construção de bibliotecas genômicas do gênero Paenibacillus buscando encontrar genes que expressam atividades enzimáticas tais como xilanase, beta-glucanase, glicosil hidrolases, bem como genes responsáveis pela fixação de nitrogênio (Lee et al., 2000; Choo et al., 2003; Cho et al., 2006; Yang et al., 2007).
O perfil de ácidos graxos de AC13MS/D (P. ourofinensis) (Tabela 3) e a identificação preliminar por meio da biblioteca MIDI confirmaram que a cepa pertence ao gênero Paenibacillus, porém não se chegou à identificação de espécie conhecida devido a baixa similaridade relativa na comparação com as espécies P. validus e P. polymyxa no banco de dados do MIDI (0,633 e 0,396) (Tabela 5). Diferenças quantitativas (iso-C15:0) e qualitativas (C16:1W7c alcohol) foram encontradas entre AC13MS/D (P. ourofinensis) e P. elgii espécie mais próxima taxonomicamente, sugerindo que a cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) realmente possa pertencer a uma nova espécie. FAME é uma técnica de classificação e identificação amplamente utilizada nos dias atuais, principalmente devido a seu baixo custo e análises rápidas de cada corrida e banco de dados FAME vêm sendo atualizados e publicados para o compartilhamento online e consulta de perfis de ácidos graxos bacterianos (Slabbinck et al., 2009).
Para classificar um micro-organismo como nova espécie são necessários inúmeros testes e comparações com espécies de grupos filogenéticos mais próximos. O
128 conteúdo GC de AC13MS/D foi determinado e a porcentagem obtida em mol foi 53,4 mol%, resultado diferente do conteúdo GC da cepa de P. elgii que possui conteúdo GC de 51,7 mol%. Os estudos de similaridade do DNA permitem a comparação entre quaisquer tipos de micro-organismos procariotos. A hibridização DNA:DNA entre dois organismos diferentes pode ser aplicada para esses fins devido a complementaridade e a capacidade de reassociação das fitas de DNA (Passaglia and Zaha, 2003). A hibridização DNA:DNA entre AC13MS/D (P. ourofinensis) e P. elgii LMG 24465 mostrou 76% de similaridade (Tabela 6). O limite geralmente aceito para delineação de espécies é de acima de 70% de similaridade DNA-DNA (Wayne et al., 1987), ou seja, a partir desse resultado a cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) pertence à espécie Paenibacillus elgii.
O resultado de 111% de similaridade ao hibridizar P. elgii LMG 24465 com AC13MS/D (P. ourofinensis) (Tabela 6) indica que provavelmente o genoma de AC13MS/D (P. ourofinensis) é maior que o genoma de P.elgii e foi possível confirmar após o sequenciamento e montagem do genoma das duas cepas. AC13MS/D (P. ourofinensis) possui um genoma de 7.812.260 pares de bases P. elgii LMG 24465 possui um genoma de 7.619.087 pares de bases. O tamanho diferente dos genomas das duas cepas, possuindo uma diferença de aproximadamente 200.000 pares de bases entre eles, é mais uma característica que indica que, mesmo se elas pertencerem a mesma espécie, são diferentes entre si.
Outra prova que as cepas AC13MS/D (P.ourofinensis) e P. elgii são diferentes foi a comparação de suas regiões intergênicas entre as regiões 16S e 23S do DNA ribossomal. P. elgii e AC13MS/D (P.ourofinensis) apresentaram diferenças entre si por meio da análise das regiões intergênicas (Figura 42). Cada banda apresentada no gel pode estar representando um operon ribossomal que serviu como molde para a amplificação da região intergênica, sendo assim, essas duas cepas possuem diferentes operons, confirmando que existem diferenças entre as cepas de P. elgii isolada na Coréia e AC13MS/D (P. ourofinensis) isolada do Cerrado brasileiro. O Polimorfismo das regiões ITS é muitas vezes devido à presença de genes que codificam tRNA, responsáveis por polimorfismos de comprimento e sequência. Este polimorfismo pode ser utilizado para discriminar as cepas bacterianas estreitamente relacionadas de espécies que possuem vários operons ribossomais diferindo em tamanho e sequência (Jensen and Straus, 1993; Gurtler and Stanisich, 1996; Jensen and Hubner, 1996;
129 Daffonchio et al., 2003). Técnicas de fingerprinting baseadas na amplificação da região intergênica 16S-23S já foram também utilizadas anteriormente para comparações entre diferentes cepas e espécies do gênero Paenibacillus e mostraram que espécies diferentes do gênero Paenibacillus possuem padrões diferentes de região intergênica mostrando que pode servir como um protocolo inicial para identificação (Coelho et al., 2003; Dingman, 2009).
O perfil de bandas entre P. elgii e AC13 (P. ourofinensis) também foi diferente utilizando a técnica RAPD. Foram verificadas diferenças entre ausência e presença de bandas e diferenças na intensidade de algumas bandas apesar do perfil de bandas dessas duas cepas ser bastante semelhante entre si, apresentando várias bandas em comum (Figura 43). A técnica RAPD permite o uso de oligonucleotídeos iniciadores de baixa estringência e com poucos nucleotídeos, os quais arbitrariamente selecionam sequências de sítios específicos do DNA genômico, onde ocorre um pareamento completo ou semi- completo a partir do DNA amplificado, permitindo a distinção de amostras da mesma espécie pela comparação do padrão genômico obtido. Esse é um dos métodos mais simples, pois a amostra de DNA não necessita ter fragmentos de grandes tamanhos ou estar altamente purificada, sendo necessários apenas alguns nanogramas da amostra para realização da RAPD (Welsh and McClelland, 1990; Kersulyte et al., 1995). A utilização dessa técnica na comparação de P. elgii e P. ourofinensis foi importante para mostrar algumas diferenças entre eles, apesar de pertencerem a uma mesma espécie em face de outras análises.
Análises filogenéticas baseadas na sequência do gene rDNA 16S foi de grande importância para definir o gênero Paenibacillus (Ash et al., 1993). Entretanto as limitações nas análises filogenéticas baseadas no 16S rDNA, devido a presença de diferentes cópias desse gene, restringe o seu uso em espécies de Paenibacillus (Berge et al., 2002). O gene rpoB tem sido usado com sucesso para elaboração de relações filogenéticas em vários grupos de bactérias, e normalmente tem um poder discriminatório maior do que sequências de 16S rDNA (Dahllof et al., 2000). Em estudo com diferentes cepas de Paenibacillus, fixadoras de nitrogênio, verificou-se que a análise do gene rpoB é uma ferramenta poderosa de identificação, e uma alternativa eficiente às analises do gene 16S rRNA, podendo ser utilizada para a discriminação correta de espécies fixadoras de nitrogênio do gênero Paenibacillus (Da Mota et al., 2004). Análises do gene rpoB também foram utilizadas no estudo da diversidade de
130 espécies de Paenibacillus em solo de Cerrado e Mata Atlântica (Da Mota et al., 2005). Por meio do estudo do gene rpoB verificamos que a alta identidade (98%) entre as sequências deste gene em P. elgii e AC13MS/D (P. ourofinensis) está de acordo com o resultado de hibridização DNA-DNA, indicando que, apesar de várias características diferentes, não podemos separar essas cepas como espécies distintas.
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6. Conclusões
A cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) isolada do solo do Cerrado brasileiro, na fitofisionomia de cerrado sensu stricto, apresenta atividade antimicrobiana. Essa atividade é observada tanto pela ação da bactéria cultivada em meio sólido quanto para o sobrenadante da cultura em meio líquido. O sobrenadante de AC13MS/D obtido utilizando meio de cultivo com Peptona de soja e NaCl apresentou atividade antimicrobiana durante 84 dias, quando mantido sob temperatura ambiente. Este teste de estabilidade da atividade antimicrobiana mostra que o sobrenadante de AC13MS/D pode ser aplicado para fins de atividade antibiótica em produtos de uso veterinário de interesse da Ourofino Agronegócio. A Ourofino Agronegócio juntamente com a Universidade Católica de Brasília estão patenteando o uso do peptídeo responsável pela atividade antimicrobiana da cepa AC13MS/D.
A construção das bibliotecas genômicas de AC13MS/D (P. ourofinensis) foi realizada com sucesso, e apesar de ainda não terem sido obtidos resultados positivos de triagem no presente trabalho, as bibliotecas de pequenos e grandes insertos estão disponíveis para futuros estudos de detecção de genes que codifiquem produtos de interesse biotecnológico.
A análise do perfil de ácidos graxos confirmou que a cepa AC13MS/D pertence ao gênero Paenibacillus e que existem diferenças quantitativas (iso-C15:0) e qualitativas (C16:1W7c alcohol) no perfil de ácidos graxos entre AC13MS/D (P. ourofinensis) e P. elgii.
A utilização das técnicas de fingerprinting (RISA e RAPD) mostrou que as cepas AC13MS/D (P. ourofinensis) e P. elgii possuem padrões de bandas diferentes. Os padrões de bandas obtidos com RISA indicam a presença de diferentes operons.
Os genomas das duas cepas pertencentes ao gênero Paenibacillus, sequenciados nesse trabalho, apresentam tamanho superior a sete milhões de pares de bases. O genoma de AC13MS/D (P. ourofinensis) possui aproximadamente 200 mil pares de bases a mais do que o genoma de P. elgii, portanto mais uma característica que comprova que as duas cepas são diferentes.
Apesar da aplicação de várias técnicas mostrarem diferenças entre as cepas AC13MS/D (P. ourofinensis) e P. elgii, a sequência de DNA, correspondente ao gene rpoB de P. elgii, mostrou 98% de identidade com a sequência do gene rpoB de
132 AC13MS/D (P. ourofinensis) indicando que são cepas bastante próximas filogeneticamente. A similaridade DNA:DNA entre elas é de 76%, superior a 70%, limite utilizado para delineação de espécie bacteriana, sendo assim, a cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) pertence à espécie Paenibacillus elgii.
Não foi possível classificar a cepa AC13MS/D do gênero Paenibacillus isolada do solo do Cerrado como uma espécie nova, ou seja, a cepa AC13MS/D é um novo isolado de Paenibacillus elgii encontrado no Cerrado brasileiro. Porém com todas as comparações apresentadas neste trabalho, propomos que a cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) seja classificada como um tipo diferente de Paenibacillus elgii, denominada Paenibacillus elgii ourofinensis.
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