RESULTS AND DISCUSSIONS. 53

Para a reação de PCR, foram utilizados: 1μl de DNA de P. elgii, AC13MS/D, Paenibacillus sp. e B. subtillis; 2μl de tampão 10x da enzima Taq Platinum; 1μl de MgCl2 (Cloreto de Magnésio – 1,4mM); 1μl de oligonuclotídeo 208 (Tabela 2); 0,5μl de Taq Polimerase Platinum; 2μl de dNTP (5mM) e 12,5μL de H2O milliQ, para um volume final de 20μl, tendo sido realizada uma mistura, a fim de otimizar os procedimentos. As amostras foram colocadas no termociclador PTC-100TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc., Water-Town, Mass, USA), sendo adicionados 10μl de óleo mineral para evitar a evaporação. A programação utilizada seguiu as recomendações de Mahenthiralingam et al. (1996), sendo que a temperatura de anelamento foi elevada de 36ºC para 40ºC. A programação utilizada foi: (i) 4 ciclos, com 1 ciclo de 5 minutos a 94ºC, 5 minutos a 40ºC, 5 minutos a 72ºC e (ii) 35 ciclos, com 1 ciclo de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 40ºC e 2 minutos a 72ºC, seguidos por um passo final de extensão de 10 minutos a 72ºC. Para verificar a diversidade do padrão de bandas obtidas em uma mesma espécie bacteriana, realizou-se a eletroforese em gel de agarose a 1% com brometo de etídio (0,5 g/mL) e tampão de corrida TBE 1X. Como marcador, utilizou-se o 1Kb Plus DNA Ladder, da Invitrogen. Essa reação de RAPD foi realizada com mais duas repetições para confirmar a veracidade dos resultados.

111 3.6.5 Análises da sequência do gene rpoB

O DNA total de P. elgii e Paenibacillus sp. foi amplificado por meio de PCR utilizando os oligonucleotídeos 1698F/2041R (Tabela 2) que são específicos para amplificar o gene rpoB, altamente conservado, que codifica a subunidade β da RNA polimerase de bactérias.

A partir do produto da PCR, foi feita a reação de ligação com o vetor pGEM-T Easy por meio da T4 Ligase (5µl de tampão 10X, 3µl de DNA; 1µl do vetor pGEM-T Easy; 1µl de T4 Ligase). Essa reação permaneceu durante a noite em termociclador a 16°C e a enzima foi inativada a 65°C durante 20 minutos. A reação de ligação foi dialisada por 30 minutos.

Foi feita a transformação em células de Escherichia coli (Epi 300). Nesse procedimento foi utilizado 10µl da reação e 50 µl de células competentes de E. coli (Epi 300) e submeteu-se a eletroporação e após foi adicionado 1 ml de meio de cultivo SOC. Após incubação por 1 h à 37 °C, a suspensão de células foi plaqueada em Placas de Petri contendo meio LB acrescido de ampicilina (150 µg/ml), uma vez que o plasmídeo pGEM-T contém o gene que confere resistência a esse antibiótico, e incubada durante 16 h em estufa à 37 °C. Após, foi realizada a extração do DNA plasmidial por Mini- prep utilizando o kit QIAGEN. A preparação de DNA plasmidial foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e analisado por eletroforese em gel de agarose 1% para confirmar a clonagem. Foram realizadas duas reações de PCR utilizando a preparação de DNA plasmidial, uma com o conjunto de oligonucleotídeos iniciadores T7/SP6 (Tabela 2) e outra com o conjunto de oligonucleotídeos 1698F/2041R. Os produtos dessas foram sequenciados.

As sequências do gene rpoB de outras espécies de Paenibacillus foram obtidas pelo website NCBI com as quais foi feito o alinhamento, por meio do programa BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/), e construção de árvore filogenética, por meio do programa MEGA4 (Tamura et al., 2007), utilizando p-distance e neighbor joining com bootstrap 1000. Bacillus subtillis foi utilizado como grupo externo.

112 Tabela 2. Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados.

Oligonuclétídeos Sequência (5' - 3') 1406F TGYACACACCGCCCGT 23SR GGGTTBCCCCATTCRG F72F TGCGGCTGGATCCCCTCCTT L1R CAAGGCATCCACCGT 208 ACGGCCGACC 1698F AACATCGGTTTGATCAAC 2041R GGTTGCATGTTGGTACCCAT T7 TAATACGACTCACTATAGGG SP6 ATTTAGGTGACACTATAG

3.6.6 Sequenciamento do genoma de AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis) e Paenibacillus elgii

A cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) e a cepa P. elgii LMG 24465 foram cultivadas à 37ºC e 28ºC, respectivamente em Placa de Petri com meio de cultura LB. Para extração de DNA total aproximadamente 0,5 g de células foram retiradas da Placa de Petri onde estavam cultivadas as cepas. O DNA total foi extraído baseado em protocolo de lise química e desproteinização por meio de lisozima, proteinase K, SDS, CTAB/NaCl, fenol/clorofórmio e álcool-isoamilico. O DNA final foi ressuspendido em TE e submetido às preparações para sequenciamento. O sequenciamento completo dos genomas das duas cepas foi realizado por meio do GS FLX Titanium (454 Life Science’s).

113

4. Resultados

4.1 Teste de estabilidade da atividade antimicrobiana do sobrenadante de AC13MS/D

O sobrenandante da cultura de AC13MS/D (P. ourofinensis) cultivado em meio LB foi testado utilizando B. subtillis como indicador sendo observado um halo de inibição em torno de 2,5 a 3 cm. O sobrenadante da cultura foi armazenado em temperatura ambiente e em temperatura à -20ºC, esta ultima utilizada como controle. O teste de atividade antimicrobiana utilizando o sobrenadante armazenado a temperatura ambiente por 70 dias resultou em uma diminuição do diâmetro do halo de aproximadamente 0,5 cm (Figura 34), e o controle permaneceu estável (Figura 34 e 35).

O teste de atividade antimicrobiana utilizando o sobrenadante obtido da cultura de AC13MS/D em meio de peptona de soja e cloreto de sódio resultou em um halo de inibição ao B. subtillis em torno de 2 a 2,5 cm. Após 20 dias, de armazenamento do sobrenadante mantido à temperatura ambiente, foi observada uma queda de aproximadamente 0,5 cm no diâmetro do halo de inibição, os valores ficaram oscilando e após 64 dias de armazenamento não foi observada a formação de halo, no entanto, com 71 dias de armazenamento foi observado um halo de inibição novamente (Figura 36), indicando que no teste feito com 64 dias pode ter acontecido tenha alguma irregularidade experimental. Foi constatado que depois de 84 dias, o sobrenadante de AC13MS/D (P. ourofinensis) crescido em meio contendo peptona de soja e cloreto de sódio, não forma mais halo de inibição na presença de B. subtillis (Figura 36). Em relação ao sobrenadante armazenado à -20 °C que corresponde ao controle, o halo de inibição foi mantido constante durante todos os testes de atividade antimicrobiana realizados (Figura 36).

114 Figura 34. Diâmetro do halo de inibição ao crescimento de Bacillus subtillis formado pelo sobrenandante da cultura da cepa AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis) crescido em meio de cultura LB, mantido à temperatura ambiente e à temperatura de -20 °C.

Figura 35. Placa de petri com o halo de inibição ao crescimento de Bacillus subtillis devido à presença do sobrenadante de AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis) crescido em meio LB no pocinho no centro da placa.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 0 7 14 21 28 35 42 49 56 71 78 85 91 106 126 Diâmet ro , c m Dias T. Ambiente Controle (-20ºC)

115 Figura 36. Diâmetro do halo de inibição ao crescimento de Bacillus subtillis formado pelo sobrenandante da cultura de AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis) crescido em meio de cultura com peptona de soja e cloreto de sódio, mantido à temperatura ambiente e à temperatura de -20 °C.

4.2 Construção da Biblioteca Genômica de AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis)

A extração do DNA total de AC13MS/D (P. ourofinensis) por meio do protocolo modificado para obtenção de grandes fragmentos de DNA foi obtida com sucesso (Figura 37).

A validação da biblioteca genômica contendo como insertos pequenos fragmentos de DNA do genoma de AC13MS/D (P. ourofinensis) está apresentada na Figura 38. Foram obtidos aproximadamente 20 mil clones e a cobertura genômica foi aproximadamente de 20 vezes. A validação da biblioteca genômica de grandes insertos, utilizando fosmídeo como vetor, está apresentada na Figura 39. Foram obtidos aproximadamente cinco mil clones e a cobertura genômica também foi aproximadamente de 20 vezes. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 7 14 21 28 35 42 49 64 71 78 84 99 119 Diâmet ro , c m Dias T. Ambiente Controle (-20ºC)

116 Figura 37. Análise por eletroforese em gel de agarose a 0,8% do DNA total extraído de AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis).

Figura 38. Eletroforese em gel de agarose a 1% da biblioteca genômica de pequenos insertos de AC13MS/D (Paenibacillus ourofinensis), onde M representa o marcador molecular Ladder 1 kb plus, C (controle) representa o plasmídeo intacto e as demais canaletas os clones digeridos com a enzima Pst I.

117 Figura 39. Gel de eletroforese em campo pulsado da biblioteca genômica contendo grandes insertos do genoma de P. ourofinensis onde M representa os marcadores moleculares, e as demais canaletas os DNAs dos clones digeridos com a enzima Not I.

4.3 Triagem para identificação de clones com atividade antimicrobiana

Ainda não foram obtidos resultados positivos para os clones de pequenos e grandes insertos, pois o experimento descrito no material e métodos não foi otimizado. O top-ágar ao ser plaqueado sobre os clones, espalhava os mesmos pela placa, não permitindo o plaqueamento de B. subtillis.

4.4 Perfil de ácidos graxos de AC13MS/D (P. ourofinensis)

O perfil de ácidos graxos de AC13MS/D (P. ourofinensis) está apresentado na Tabela 3. A comparação dos resultados obtidos com outras espécies do mesmo gênero

118 está apresentada na Tabela 4. A identificação preliminar por meio da biblioteca MIDI demonstrou que a nova cepa pertence ao gênero Paenibacillus, mas não pode ser claramente identificada como uma espécie conhecida (Tabela 5). Diferenças quantitativas (iso-C15:0) e qualitativas (C16:1W7c alcohol) foram observadas entre AC13MS/D (P. ourofinensis) e seu vizinho mais próximo P. elgii.

Tabela 3. Perfil de ácidos graxos de P. ourofinensis.

RT Response Ar/Ht RFact ECL Peak Name Percent Comment1 Comment2

1,650 5,134E+8 0,035 ---- 6,957 SOLVENT PEAK ---- < min RT

4,967 662 0,034 1,022 12,169 11:0 2OH 0,49 ECL deviates 0,009

6,769 4115 0,038 0,996 13,618 14:0 ISO 2,94 ECL deviates -0,001 Reference -0,002 7,291 1980 0,042 0,989 13,999 14:0 1,41 ECL deviates -0,001 Reference -0,003 8,254 8516 0,040 0,980 14,624 15:0 ISO 5,99 ECL deviates 0,001 Reference -0,001 8,396 76805 0,041 0,978 14,715 15:0 ANTEISO 53,95 ECL deviates 0,002 Reference 0,000 9,487 2881 0,043 0,969 15,389 16:1 w7c alcohol 2,01 ECL deviates 0,002

9,652 680 0,045 0,968 15,488 Sum In Feature 2 0,47 ECL deviates 0,000 14:0 3OH/16:1 ISO I 9,760 717 0,043 0,967 15,552 16:0 N alcohol 0,50 ECL deviates 0,002

9,886 10645 0,043 0,967 15,628 16:0 ISO 7,39 ECL deviates 0,001 Reference -0,002 10,107 6836 0,043 0,965 15,759 16:1 w11c 4,74 ECL deviates 0,002

10,508 5890 0,043 0,963 15,999 16:0 4,07 ECL deviates -0,001 Reference -0,004 10,743 886 0,052 0,962 16,134 15:0 ISO 3OH 0,61 ECL deviates 0,000

10,902 861 0,043 0,961 16,225 15:0 2OH 0,59 ECL deviates 0,006 11,190 1008 0,040 0,960 16,390 ISO 17:1 w10c 0,70 ECL deviates 0,002

11,369 2261 0,070 0,960 16,493 Sum In Feature 4 1,56 ECL deviates 0,007 17:1 ANTEISO B/i I 11,606 2229 0,048 0,959 16,629 17:0 ISO 1,54 ECL deviates -0,001 Reference -0,003 11,768 7595 0,048 0,958 16,722 17:0 ANTEISO 5,23 ECL deviates -0,001 Reference -0,003 12,517 2267 0,052 0,957 17,149 16:0 ISO 3OH 1,56 ECL deviates -0,001

13,174 3332 0,048 0,958 17,519 16:0 3OH 2,29 ECL deviates 0,000

14,313 1022 0,052 0,961 18,162 17:0 ISO 3OH 0,71 ECL deviates 0,001 Reference 0,000 14,481 1828 0,051 0,962 18,257 17:0 2OH 1,26 ECL deviates 0,003

---- 680 --- ---- ---- Summed Feature 2 0,47 12:0 ALDE ? unknown 10,928 ---- 2261 --- ---- ---- Summed Feature 4 1,56 17:1 ISO I/ANTEI B 17:1 ANTEISO B/i I

119 Tabela 4. Composição total de ácidos graxos de P. ourofinensis e comparação com cepas do mesmo gênero filogeneticamente próximas (Meehan et al., 2001; Kim et al., 2004; Lee et al., 2004), ND = Not detected.

Fatty acid P. ourofinensis P.elgii SD17 P.elgii SD18 P. ehimensis P. validus P. koreensis P. azoreducens

Saturated C14:0 1,4 1,9 1,0 1,0 2.1 (1.8-2.5) 1,2 3,5 C15:0 0,6 1,2 1,0 1,2 0.9 (0.8-1.1) 0,8 0,1 C16:0 4,1 9,7 6,2 7,1 5.6 (5.4-5.6) 8,5 22,1 Branched iso-C14:0 2,9 2,1 1,3 1,8 3.4 (3.1-3.9) 1,6 0,8 iso-C15:0 6,0 10,6 13,7 8,1 10.3 (9.7-11.3) 6,0 5,9 anteiso-C15:0 54,0 54,1 62,0 52,9 51.9(50.6-52.7) 43,4 33,9 iso-C16:0 7,4 6,5 3,6 8,6 7.2 (6.9-7.5) 12,2 8,6 iso-C17:0 1,5 3,2 2,6 3,3 2.7 (2.2-3.5) 5,5 5,6 anteiso-C17:0 5,2 6,2 6,1 8,0 4.5 (3.9-5.0) 11,9 19,8 Unsaturated C16:1W7c acohol 2,0 ND ND 1,2 2.6 (2.5-2.7) 1,4 ND C16:1W11c 4,7 4,5 2,5 5,2 7.0 (6.7-7.6) 5,4 ND

Tabela 5. Índice de similaridade entre AC13MS/D e outras cepas do mesmo gênero por meio de MIDI.

Indice de Similaridade (IS) Espécie

0,633 Paenibacillus validus (Bacillus gordonae) 0,396 Paenibacillus polymyxa (Bacillus)

4.5 Avaliação da cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) pelo BCCM/LMG Bacteria Collection da Bélgica

Além da cepa AC13MS/D (P. ourofinensis), foram analisadas culturas de Paenibacillus elgii LMG 24465, Paenibacillus ehimensis LMG 18048 e Paenibacillus validus LMG 11161. Após a extração do DNA total foi feita a determinação do conteúdo G+C de P. ourofinensis utilizando HPLC. A porcentagem obtida em mol foi 53,4% e esse valor representa a média de três análises independentes da mesma amostra de DNA. As hibridizações DNA:DNA foram feitas a 44°C e as homologias reportadas na Tabela 6 é a média de, no mínimo, duas hibridizações. O desvio padrão médio foi de

120 14 unidades, porém desvios de 20-25 unidades ainda foram aceitos. A cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) ao ser hibridizada com a cepa de P. elgii apresentou 76% de homologia e a cepa P. elgii ao ser hibridizada com a cepa AC13MS/D (P. ourofinensis) apresentou 111% de homologia (Tabela 6).

Tabela 6. Resultado da hibridização DNA:DNA entre as cepas em porcentagem de homologia.

Cepas % Homologia de DNA

P. ourofinensis P. elgii P. ehimensis P. validus

Paenibacillus ourofinensis 100 76 54 19

Paenibacillus elgii 111 100 55 11

Paenibacillus ehimensis 56 68 100 12

Paenibacillus validus 6 8 13 100