3.5.1. Delineamento experimental
O delineamento experimental utilizou três tratamentos, com seis repetições cada:
Tratamento T-01: utilizou-se água tratada procedente da rede de abastecimento d’água da AGESPISA (Águas e Esgotos do Piauí S.A) para abastecimento e renovação do volume d’água nos tanques experimentais. Foi fornecida ração comercial balanceada indicada para cada fase do desenvolvimento dos peixes.
Tratamento T-02: utilizou-se o esgoto doméstico tratado em lagoas de estabilização. Não foi fornecido alimento suplementar.
Tratamento T-03: repetiu-se a condição básica do tratamento T-02, com a adição de oxigênio gerado por compressor radial.
Na Figura 19 é representado o esquema operacional da Unidade Experimental de Réuso da ETE-Leste.
A água utilizada no tratamento T-01, para abastecimento e renovação do volume d’água dos tanques, só foi usada após ser armazenada por 48 horas em reservatório elevado situado na área experimental, com capacidade de 2800 litros, para neutralizar o cloro ativo existente na rede de distribuição. Nos 18 tanques experimentais foram estocados alevinos de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus), revertidos sexualmente para machos em lotes de 10 indivíduos por tanque (aproximadamente 3 alevinos/m²).
3.5.2. Acompanhamento de parâmetros ambientais e de qualidade d’água
Foram analisados os parâmetros de qualidade da água do efluente final do sistema de tratamento de esgotos da zona leste de Teresina, no Laboratório Central da Coordenação de Tratamento de Esgotos da AGESPISA e Laboratório de Saneamento da UFPI, segundo metodologia descrita em APHA (2005).
As coletas de amostras foram realizadas sempre no período matutino, entre 8:00h e 11:00h, seguindo um planejamento pré-estabelecido para o monitoramento de resultados, cujas análises obedeceram a uma periodicidade quinzenal para a maioria dos parâmetros, com exceção da temperatura, pH e oxigênio dissolvido, cuja freqüência foi semanal.
O conjunto dos demais parâmetros analisados foi constituído por: alcalinidade, DQO / DBO (demanda química de oxigênio e demanda bioquímica de oxigênio – parâmetros indicadores de matéria orgânica), nitratos (N – NO3-), nitritos (N – NO2-), amônia (N-NH3), condutividade elétrica, fósforo total, ortofosfato, sólidos totais, sólidos suspensos, sólidos sedimentáveis, clorofila–a, transparência, coliformes termotolerantes e totais.
A temperatura, OD, N-NH3, pH, bem como, as análises para coliformes totais e termotolerantes foram os principais parâmetros destinados ao monitoramento da atividade píscicola. Os outros parâmetros físicos químicos referem-se à avaliação da água e do esgoto tratado (lagoas de estabilização), aduzidos para unidade experimental. Na tabela 12 estão relacionados os parâmetros, métodos e equipamentos utilizados para respectivas medições.
Parâmetros Métodos Equipamentos
Temperatura Eletrométrico pHmetro / termômetro - WTW pH 330i
pH Eletrométrico pHmetro / termômetro - WTW pH 330i
Oxigênio Dissolvido (mg O2 / L) Eletrométrico Oximetro – HANNA –HI 9146
Alcalinidade (mg/L) Titulométrico Neutralização (APHA, 2005) -
Sólidos (mg/L) Gravimétrico Muflas; Estufas e Balanças Analíticas.
Condutividade (µS/cm) Eletrométrico Multímetro / WTW – INOLAB MULTI 720
Fósforo (mg/L) Espectrofotométrico/Persulfato de Amônia Espectrofotômetro DR 2800 HACH Ortofosfato (mg/L) Espectrofotométrico/Ácido Ascórbico Espectrofotômetro DR 2800 HACH Nitrato (mg/L) Espectro./ Salicilato de Sódio / Rodier Espectrofotômetro DR 2800 HACH Nitrito (mg/L) Espectro/ Sulfanilamida / Ethilenodiamina Espectrofotômetro DR 2800 HACH
Amônia (mg/L) Espectro/ Nesselerização Direta Espectrofotômetro DR 2800 HACH
Coliformes Método Colilert Seladora QalliTray / Estufa / Lâmpada UV
DBO Descrito em APHA (2005) Frascos Padrão e Incubadora de DBO
DQO Refluxação Fechada do Dicromato. Bloco Digestor CIENLAB Dry Block.
Clorofila-a Método de Jones. Extração a Quente com metanol 100%;
Espectrofotométrico. Espectrofotômetro DR 2800 HACH
Para revitalizar de forma sistemática a oferta de nutrientes, naturalmente encontrados no efluente de esgoto doméstico tratado, foi adotado o procedimento de renovação diária em 15% do volume útil dos tanques abastecidos com esgoto. Igual processo de renovação foi realizado para os tanques cujo tratamento utilizou água da rede de abastecimento da cidade. Além da renovação diária da água, foi realizada também a operação de sifonamento semanal da camada de resíduos do fundo dos viveiros.
3.5.3. Avaliação primária da comunidade planctônica
Os organismos zooplanctônicos têm valor potencial na avaliação das condições tróficas de ambientes aquáticos, por responderem rapidamente às mudanças ambientais e refletirem as alterações súbitas na qualidade das águas (GUNTZEL; ROCHA, 1998). O zooplâncton limnético é importante para melhorar a qualidade da água, controlando o desenvolvimento do fitoplâncton através de sua alimentação seletiva. Dentro da comunidade planctônica, o zooplâncton é o principal elo na transferência de energia sistematizada e armazenada pelo fitoplâncton para os componentes de outros níveis tróficos (SILVA FILHO, 2002).
O zooplâncton foi amostrado no mês de maio de 2010 em nove tanques, do total de dezoito, que foram selecionados de maneira intercalada: três com água tratada com fornecimento de ração para os peixes; três com esgoto tratado sem aeração e três com esgoto tratado com adição de oxigênio. Para a coleta das amostras, utilizou-se rede com 45 µm de abertura de malha, 50 cm de diâmetro de boca e 1 m de comprimento. O material coletado foi fixado com solução de formol a 4% e acondicionado em frascos plásticos devidamente identificados.
As amostras foram levadas para o laboratório de Limnologia do Departamento de Biologia da UFPI, onde foram feitas determinações qualitativas das espécies de zooplâncton. Para a observação do material, utilizou-se uma lupa OLYMPUS SZ40, para as espécies de maiores dimensões, como os Cladocera e Copepoda, e um microscópio OLYMPUS BX41 para os Rotíferos. Com o auxílio de bibliografia especializada, foi feita a identificação das espécies representantes dos grupos da comunidade zooplanctônica (ELMOOR-LOUREIRO, 1997; REID, 1984). Os organismos, sempre que possível, foram identificados no nível de espécie.
As amostras para determinação das espécies de algas, e população dominante nos tanques experimentais, também foram coletadas no mesmo período e com equivalente número das amostras utilizadas para as análises de zooplancton. As observações e determinações foram realizadas no laboratório de microbiologia da ETE-Leste da Agespisa, com um microscópio binocular com capacidade de 10X.
Para análise da concentração de clorofila-a, as amostras foram filtradas em sistemas de filtração a vácuo, e com o material retido no meio filtrante foi produzido uma solução com álcool metílico (100%) para extração dos pigmentos. Na seqüência, esta solução passou por processo de centrifugação para separação do líquido, e a biomassa algal extraída foi analisada em espectrofotômetro.
3.5.4. Avaliação da capacidade de produção de peixes com esgoto doméstico tratado em lagoa de estabilização
Utilizaram-se alevinos de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus), sexualmente revertidos para machos, provenientes da Estação de Piscicultura “Ademar Braga”, de propriedade do Departamento Nacional de Obras Contra Secas (DNOCS), localizada no município de Piripiri-PI.
O transporte para Teresina e aclimatação dos peixes na Unidade Experimental da Agespisa foi feito observando todos os critérios recomendados para este tipo de operação e, o contato dos alevinos com o esgoto foi do tipo gradual, pois o ambiente dos viveiros teve a concentração gradativamente elevada.
A capacidade de suporte do ambiente em produzir peixes pode estar limitada pela quantidade e qualidade do alimento e/ou pelas limitações de qualidade da água causadas pelo aumento da biomassa dos peixes (PEREIRA, 2004). O estudo da capacidade de suporte foi baseado nas experiências de PROENÇA; BITTENCOURT (1994), PEREIRA (2004) e SANTOS (2008).
Após o período de aclimatação, foi realizada a primeira biometria para caracterização da população inicial que estava sendo estocada na unidade experimental, ou seja, 60 alevinos para cada um dos três tratamentos, perfazendo 180 peixes. As biometrias repetiram-se a cada 28 dias durante o período experimental, que foi de 154 dias, oportunidade em que os dados biométricos já indicavam a proximidade do nível crítico de suporte à vida dos peixes.
Em cada biometria, os peixes foram medidos com paquímetro digital Western com capacidade máxima de 150 mm e, após superar este limite, a medição foi realizada com ictiômetro (precisão de 0,1 mm). Para pesagem dos animais foi utilizada uma balança digital da WCT com capacidade máxima de 3 kg e precisão de 0,5 g. Com os resultados neste processo avaliaram-se os principais parâmetros zootécnicos, apresentados na Tabela 13.
Tabela 13 - Principais parâmetros zootécnicos analisados para os peixes cultivados nos tratamentos T-01, T-02, T-03.
*Calculada apenas para T- 01.
Utilizou-se na alimentação dos indivíduos submetidos ao tratamento T-01, água tratada com adição de ração, Fri-Acqua fabricada pela Fri-Ribe e comercializada nas lojas de produtos agropecuários. Inicialmente, até o terceiro mês de cultivo, usou-se ração para engorda de peixes com um teor de 40% proteínas, quando foi substituída pela ração com 28% de proteína até a última biometria.
3.5.5. Qualidade do pescado produzido com esgoto doméstico tratado
3.5.5.1. Análises Microbiológicas
As análises microbiológicas foram realizadas no Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de Alimentos (NUEPPA), da Universidade Federal do Piauí (UFPI), onde foram adotados os procedimentos para verificação da presença de microrganismos do tipo: Coliformes, Salmonella sp (presença e ausência),
Staphylococcus aureus (UFC - Unidades formadoras de colônias), nas amostras dos peixes de cada tratamento utilizado na piscicultura experimental .
PARÂMETROS ZOOTÉCNICOS UNIDADES
Crescimento em comprimento (cm)
Crescimento diário (cm/dia)
Ganho de peso (g)
Ganho de peso diário (g/dia)
Produtividade (kg/ha/dia)
Após a última biometria (6ª), foram enviadas três amostras, cada uma com seis peixes por tratamento (T-01, T-02, T-03), abatidos por hipotermia, para o laboratório (NUEPPA), devidamente acondicionados em embalagens estéreis, identificadas e transportadas em caixa de isopor com gelo.
Para a quantificação de coliformes a 37ºC e a 45ºC foi utilizada a técnica da múltipla fermentação em tubos, realizando o cálculo do número mais provável (NMP) de acordo com procedimento adotado nesta técnica. Na pesquisa de
Staphylococcus coagulase positiva, e Salmonella spp, foram adotados procedimentos padronizados, utilizando-se meios de cultura especiais (Ágar Baird- Parker (ABP), Caldo Rappaport-Vassilidis Soja (RVS) e Caldo Selenito de Sódio) com período de incubação específico para cada análise. Em seguida, foi feita a leitura das placas para verificação de eventuais presenças de colônias dos microorganismos analisados.
As análises para pesquisa de ovos de helmintos e cistos de Entamoeba
histolytica foram realizadas no Laboratório de Sanidade Animal (LASAN), da UFPI. Foram colhidas amostras com o total de 1000 mL da água de abastecimento dos tanques, sendo 500 mL pela manhã e 500 mL à tarde, durante cinco dias consecutivos.
As amostras foram processadas pelo método de sedimentação simples de Hoffmann (1934) para pesquisa de ovos de trematódeos, cestódeos e cistos de
Entamoeba histolytica, onde foram observadas cinco laminas de cada amostra. Para pesquisa de ovos de nematódeos e oocistos de protozoários foi utilizado o método de Willis. Os métodos empregados nestas análises estão descritos em De Carli (2007), e todas as observações foram realizadas em microscópio de luz com objetivas 10 e 40X.
3.5.5.2. Análise sensorial
As características sensoriais do pescado são claramente visualizadas pelos consumidores e os métodos sensoriais são, ainda, as ferramentas mais completas na avaliação do frescor do pescado, uma vez que elas dão a melhor idéia da aceitação do consumidor (CONNEL, 1995 apud TEIXEIRA, 2005).
Foram enviadas 02 amostras com 6 peixes de cada tratamento para o laboratório de Análise Sensorial do Curso de Nutrição da Universidade Federal do
Piauí (UFPI), onde foram realizados os Testes Sensoriais Afetivos de preferência e aceitabilidade de tilápias (Oreochromis niloticus), com 50 provadores adultos de ambos os sexos, não treinados.
No Teste de aceitação foi avaliado quanto (intensidade) o consumidor gosta ou desgosta do produto que lhe é oferecido. Por outro lado, o teste de preferência foi o instrumento utilizado para aferir a preferência (opção) que o consumidor tem sobre um produto em relação a outro que esteja sendo comparado.
Para examinar a aceitabilidade foi aplicado o teste escala hedônica de nove pontos (Dutcosky,1996), avaliando itens desde “gostei muito” até “desgostei muitíssimo”. O teste pareado de preferência (Ferreira, 1999) foi utilizado para verificar a preferência dos consumidores entre os tratamentos.
Foi elaborado um banco de dados no programa Epi – Info, versão 6.04 b (Dean
et al.,1994), de modo que todas as características sensoriais de aparência, sabor, aroma e textura detectáveis no produto, pudessem ser comparadas. Os resultados foram avaliados por análise de variância (ANOVA) e aplicação do teste do qui- quadrado (²), com nível de significância de 5%.
3.5.5.3. Índice do rigor mortis (IRM)
O frescor é um dos atributos mais importantes quando se avalia a qualidade do pescado. Para avaliar a condição do frescor do pescado produzido neste experimento, foram aplicados os testes para conhecimento do IRM (Figura 20), ou seja, o índice do rigor mortis dos peixes produzidos nos tratamentos pesquisados.
O rigor mortis é caracterizado pela perda da plasticidade e extensibilidade dos músculos como resultado da alteração dos ciclos de contração e relaxamento muscular (CONTRERAS, 1994). Este processo se inicia logo após a morte, sendo esta a transformação inicial que ocorre no peixe, seguida da ação autolítica das enzimas musculares e a ação dos microorganismos, finalizando com a total deterioração do pescado.
Nesta pesquisa, o teste para o rigor mortis teve o objetivo de verificar se a ação da carga bacteriana contida no esgoto doméstico tratado tinha influência relevante no IRM, e no pH medido na musculatura dorsal do peixe, durante os tempos de entrada, permanência e saída do estágio de rigor mortis.
Selecionaram-se seis animais de cada tratamento, que foram sacrificados usando hipotermia, pois este é um dos procedimentos de menor estresse no instante anterior ao abate, posto que o método utilizado para sacrificar o peixe pode acelerar ou atrasar o início do rigor (MACEDO-VIÉGAS; SOUSA, 2004). Posteriormente, as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos dentro de caixa térmica com gelo triturado. Todo este material foi analisado no Laboratório de Pesquisa em Piscicultura do Centro de Ciências Agrárias (LAPESP) da UFPI. Para o cálculo do IRM, foi utilizada a fórmula proposta na metodologia descrita por Bito et. al (1983), e apresentada a seguir:
IRM (%) = [(D0-D) / D0 ] x 100
Figura 20 - Teste para o índice de rigor
mortis (IRM).
IRM = Índice de Rigor Mortis; D0 = Distância inicial entre a
superfície, da bancada e a base da nadadeira caudal;
D = Distância final entre a superfície, da bancada e a base da nadadeira caudal.
3.5.5.4. Teste de genotoxicidade
Vários biomarcadores têm sido usados para a detecção de exposição à genotóxicos em poluição de águas, e os eritrócitos de peixes podem ser usados como marcadores sentinelas da exposição a compostos mutagênicos (BOMBAIL et
al., 2001; MITCHELMORE; CHIPMAN,1998).
A análise de micronúcleos foi realizada pelo laboratório de Citogenética do Centro de Ciências da Natureza (CCN) da UFPI, com adaptações no protocolo usado por Cavas; Konen (2007), para as análises de micronúcleos e de anormalidades nucleares, tais como cariorrexe (fragmentação nuclear) e cariólise (dissolução nuclear). Foram coletadas amostras de sangue de 15 peixes do tratamento (T-01), 27 do tratamento (T-02) e 22 do tratamento (T-03); 15 peixes foram avaliados no controle negativo (água de poço artesiano) e 15 para o controle positivo (metabissulfito de sódio).
A coleta de 1 mL do sangue dos animais para preparo das lâminas foi feita individualmente nas brânquias, com seringa descartável, e encaminhada para o laboratório de citogenética, obedecendo todos os critérios de segurança e integridade das lâminas, tanto no acondicionamento quanto no transporte deste material. As amostras de sangue periférico das brânquias foram usadas em esfregaços de duas lâminas para cada peixe e, depois de fixadas em etanol puro por 20 minutos, as lâminas foram coradas em solução de Giemsa a 10%, por 25 minutos.
Finalmente, foram avaliados 1000 eritrócitos para cada peixe em microscopia óptica, com a objetiva de 100 X, e máquina fotográfica digital Sony (7.0MB) para produção de imagens. E, para a análise estatística dos parâmetros utilizados na avaliação da mutagenicidade, utilizou-se o Dunnett’s Multiple Comparison Test, e Análise de Variância (ANOVA).
3.5.5.5. Teste de bioimpedância (ângulo de fase)
A condição do peixe se refere à sua habilidade para competir com sucesso, manter as funções vitais e sobreviver no seu ambiente (Brown; Murphy, 1991). Em pesquisas, realizadas por Willis; Hobday (2008); Ducan (2008) e Cox; Heintz (2009) foi destacada a viabilidade de avaliação da condição do peixe com base na determinação do ângulo de fase, em testes de bioimpedância elétrica (BIA).
Após a execução da última biometria do ciclo experimental na piscicultura da ETE-Leste (Agespisa), foi realizado o teste de bioimpedância em amostras (20 peixes) de cada um dos tratamentos (T-01, T-02, T-03), com o propósito de determinar o ângulo de fase (ÂF). Foram inseridos eletrodos, pares de agulhas (28 x 0,9mm), fixadas em suporte de acrílico (Figuras 21 A e B), em pontos padronizados na região dorsal dos peixes (Figura 21 C) devidamente insensibilizados por indução anestésica com solução a base de eugenol conforme Vidal et. al (2008). Os eletrodos foram conectados ao plessímetro tetrapolar modelo BIA-101Q da RJL Systems, para leitura da resistência (R) e reatância (Xc) elétricas.
Em seguida, calculou-se o ângulo de fase (ÂF) e impedância (Z), usando-se, respectivamente, as fórmulas: ÂF= [arco-tangente (Xc/R)]x(180°/π) e Z = (R² + Xc²)1/2 apresentadas em Foster; Lukaski (1996), Lukaski et al., (1985) e Barbosa Silva et al., (2003). A Figura 21 (D) apresenta o plessímetro em operação para medir os parâmetros necessários ao cálculo do ângulo de fase.