5.5 Hva nå?
5.5.2 Et steg tilbake, to frem
A heterofucana SF-1,5v, extraída da alga marrom S. filipendula apresentou atividade antitumoral célula-específica, inibindo a proliferação da linhagem tumoral HeLa após incubação por 72 h. Para uma melhor dinâmica experimental na determinação dos mecanismos de ação, as celulas HeLa foram incubadas com SF- 1,5v por períodos de 24 h e 48 h, a fim de verificar se esta apresenta atividade antiproliferativa em tempos inferiores à 72 h. A inibição tempo-dependente de SF- 1,5v sobre a proliferação celular de células HeLa pode ser visto na Figura 26. SF- 1,5v inibiu a proliferação celular em 47,3% no tempo de incubação de 24 h (2,0 mg/mL). Estes valores são consideravelmente superiores ao encontrado para outros polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marrons do gênero Sargassum, como fucanas obtidas de S. kjellmanianum e S. stenophyllum que não inibiram mais que 40% da proliferação das células L-1210 (linhagem linfocitária leucêmica) e HeLa, respectivamente (YAMAMOTO et al., 1984, STEVAN et al., 2001). Portanto, levando em consideração que SF-1,5v promove um decréscimo antitumoral significativo diante das células HeLa em um período de 24h, decidiu-se adotar este tempo de incubação como padrão para os ensaios posteriores.
Para confirmar se a inibição da proliferação celular mostrada no experimento anterior se deve a indução da apoptose, as células HeLa foram incubadas com a heterofucana SF-1,5v, seguido de marcação com anexina V-FITC (proteína anexina V unida à isotiocianato de fluoresceína) e iodeto de propídeo (PI). A análise dos resultados foi feita através da citometria de fluxo (Figura 27). A Anexina V-FITC caracteriza-se por se ligar à fosfatidilserina (FS), um fosfolipídio de membrana localizado no lado intermembrana de células vivas. Durante os eventos que levam a apoptose, ocorre a sua externalização ativamente para a camada externa da membrana plasmática, onde sua presença e requerida para o reconhecimento e fagocitose da célula morta (CHEN et al., 2011). Por sua vez o PI caracteriza-se por
DISCUSSÃO
109atravessar a membrana citoplasmática de células necróticas, permitindo desta forma a sua rápida identificação. A partir do tratamento com SF-1,5v podemos verificar que houve um aumento significativo de células em estagio inicial de apoptose (19,8%), confirmando que o principal mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v é através da indução da apoptose.
Duas vias celulares, conhecidas como via extrínseca e via intrínseca da apoptose podem desencadear os mecanismos apoptóticos (CHAUDHARI et al., 2008, JEONG & SEOL, 2008) Figura 4Figura 4 e Figura 5), e em ambas as vias as
caspases desempenham papel chave: caspase-8 e caspase-9 como iniciadoras das vias extrínseca e intrínseca, respectivamente, e caspase-3 como efetora das duas vias. Estas vias, monitoradas principalmente através da ativação da procaspase-9 e procaspase-3, aparecem como o principal mecanismo antitumoral de diversos polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas (AISA et al., 2005, TERUYA et al., 2007).
Portanto, SF-1,5v foi avaliado quanto a capacidade de ativar a via das caspases através da técnica de western blot (Figura 28A). Nenhuma alteração foi observada nos conteúdos das duas procaspases aqui analisadas, procaspase-3 e procaspase-9, indicando que SF-1,5v provavelmente desempenha sua atividade antiproliferativa através de uma via diferente da ativação das caspases. Este resultado foi confirmado após incubação das células HeLa com um inibidor específico de caspase, zVAD, na presença e na ausência de SF-1,5v (Figura 28B). zVAD não alterou a proliferação celular de HeLa, ratificando que a ativação de caspase não é essencial para SF-1,5v induzir a apoptose em células HeLa.
Alguns trabalhos mostram que a ativação das caspases não necessariamente leva à morte celular, o que mostra a importância de outras vias independente de caspase no processo de apoptose. Uma fucana extraída de F. vesiculosus induz a expressão de caspase-3 e reduz o potencial elétrico mitocondrial de células HS- sultan. Entretanto, experimentos com inibidores de caspases mostraram que a ativação de caspases era responsável por apenas 69% da atividade apoptótica do polissacarídeo, indicando que outras vias independentes de caspases estão envolvidas na indução da morte celular, especificamente, a ativação de ERK (extracellular signal–regulated kinase) (AISA et al., 2005). Em trabalhos posteriores, esta mesma fucana inibiu a proliferação de células HCT-15 (linhagem tumoral de cólon) através da ativação de ERK e p38 e do bloqueio de PI3K/AKt (HYUN et al.,
DISCUSSÃO
1102009b), bem como através da produção de óxido nítrico induzida pela ativação de NFkB (NAKAMURA et al., 2006).
Neste trabalho, outras vias indutoras de morte celular independentes de caspases foram avaliadas quanto ao efeito do tratamento de HeLa com SF-1,5v. Devido a MAPK, uma família de proteínas quinases ativadas por mitógenos, estar diretamente envolvida nos processos de proliferação, diferenciação e apoptose (MIYAKAWA et al., 2001, GALLO & JOHNSON, 2002, KAPUR et al., 2002), foi estudada a fosforilação de ERK e p38 através de western blot (Figura 29). SF-1,5v não alterou a fosforilação destas duas proteínas, indicando que a via MAPK não é afetada pela heterofucana. AKt, outra proteína quinase, tem um papel chave em múltiplos processos celulares, como o metabolismo de glicose, proliferação, e é fundamental à sobrevivência celular através da supressão da apoptose (NICHOLSON & ANDERSON, 2002, SCHEID & WOODGETT, 2003), logo, o bloqueio de AKt promove a inibição da proliferação e a indução da apoptose. Novamente, SF-1,5v não alterou o padrão de fosforilação de AKt.
O fator de transcrição NFkB está envolvida na expressão de genes que participam de processos imunológicos, apoptóticos e tumorigênicos, e pode ser ativado por estímulos apoptóticos envolvidos em danos no DNA, induzindo a expressão de uma variedade de genes pró-apoptóticos. Quando incubada com SF- 1,5v por 24h, a fosforização de NFkB também não pôde ser observada (Figura 29).
A proteína quinase GSK-3β tem sido associada a uma diversidade de processos biológicos, entre eles a apoptose, o que a torna uma excelente candidata em terapias antitumorais (LUO, 2009). Percebe-se claramente, que o conteúdo de GSK-3β fosforilado é alterado após incubação com SF-1,5v, indicando que a heterofucana promove a desfosforilação (ativação) de GSK-3β. Esta proteína promove a ativação de uma gama de moléculas, entre elas a proteína supressora de tumor p53 (LUO, 2009), que mantêm a integridade do genoma, prevenindo desta forma, o aparecimento de tumores (ZHELTUKHIN & CHUMAKOV, 2010), logo a ativação de p53 foi avaliada. Entretanto, esta proteína não foi afetada por SF-1,5v.
A desfosforilação de GSK-3β está envolvida no processo de apoptose, indicando que SF-1,5v provavelmente induz morte celular através da ativação desta proteína. Para determinar o papel de GSK-3β na apoptose induzida pelo polissacarídeo sulfatado nas celulas HeLa, estas foram incubadas com cloreto de litium, um inibidor específico de GSK-3β, e o número de células em apoptose foi
DISCUSSÃO
111quantificado através de citometria de fluxo (Figura 30). O cloreto de lítio não alterou a apoptose induzida por SF-1,5v, mostrando que GSK-3β também não é essencial para a atividade apoptótica deste polissacarídeo sulfatado em células HeLa. Um resultado semelhante foi relatado para fucana de F. vesiculosus, que promove desfosforilação de GSK-3β, mas este efeito não está envolvido na morte celular de células HS-sultans induzida por fucana (AISA et al., 2005).
Foi observado até aqui, que a heterofucana SF-1,5v induz apoptose em células HeLa por uma via independente da ativação de caspases. Ainda, os resultados anteriores mostraram que SF-1,5v não altera as vias de sinalização de NF�B, Akt, GSK-3�, MAPK (ERK and p38) e GSK.
Estudos mostram que a mitocôndria, além da participação na via intrínseca da apoptose, também libera fatores envolvidos no processo de morte celular independente de caspases. Mais recentemente, foi descrita a liberação, na via mitocondrial, de uma flavoproteína conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF) (SMITH et al., 2008, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010, MCMILLAN & QUADRILATERO, 2011, SEVRIOUKOVA, 2011).
AIF migra da mitocôndria para o núcleo após um estímulo de apoptose e induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em fragmentos de 50Kb, independente da ativação das caspases (GRIVICICH et al., 2007, AKEMATSU & ENDOH, 2010, MCMILLAN & QUADRILATERO, 2011). AIF também induz exposição de fosfatidilserina na superfície celular e pode manter a atividade apoptótica na presença do inibidor pan-caspase (z-VAD) (HANGEN et al., 2010). Visto que o tratamento com SF-1,5v induz exposição de fosfatidilserina na superfície celular e a atividade apoptótica é mantida na presença de z-VAD, nós mensuramos AIF citosólico através de western blot (Figura 31). Os níveis de AIF no citosol aumentaram de maneira tempo-dependente após tratamento com SF-1,5v, indicando que o principal mecanismo de morte celular induzido pela heterofucana é através da liberação mitocondrial de AIF no citoplasma.
Como as proteínas Bcl-2 e Bax, apresentam papel chave na liberação de AIF no citoplasma, a primeira inibindo esse processo, e a segunda favorecendo a permeabilização da membrana, entrada de íons cálcio e consequente liberação do fator no citoplasma celular, estas também foram avaliadas quanto a influencia de SF- 1,5v em suas concentrações. Fica claro que SF-1,5v promove a supressão da expressão de Bcl-2, ao mesmo tempo em que induz a expressão de Bax (Figura 31).
DISCUSSÃO
112A partir desses resultados pode ser proposto um esquema para os eventos envolvidos na morte celular de HeLa induzidas por SF-1,5v (Figura 32). Inicialmente, SF-1,5v promove alterações na expressão das proteinas BCL-2 e Bax, suprimindo a primeira e promovendo a expressão da segunda no citoplasma. Bax, por sua vez, promove o aumento da permeabilidade da membrana externa mitocondrial, o que leva a liberação de diversos fatores, entre eles o AIF. Em seguida, AIF induz a celula à apoptose, possivelmente através de ligacao ao DNA, e consequente recrutamento e ativação de endonucleases, promovendo a degradação do DNA em fragmentos de 50Kb, bem como a condensação da cromatina e a formação de corpos apoptóticos (CREGAN et al., 2004, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010).
Por fim, este trabalho é o primeiro relato mostrando uma fucana cujo principal mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol. Desta forma, SF-1,5v aparece como um promissor fármaco na terapia antitumoral, principalmente por oferecer uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais, afetando uma via de sinalização celular diferenciada. Estudos mais aprofundados estão sendo desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa com o objetivo de purificar
DISCUSSÃO
113SF-1,5v, determinar a sua estrutura química e avaliar os mecanismos de ação antiproliferativo frente à outras linhaiens celulares tumorais.
CONCLUSÕES
114 6 – CONCLUSÕESOs extratos ricos em polissacarídeos sulfatados extraídos das onze macroalias marinhas apresentaram efeito anticoaiulante, antioxidante e/ou antiproliferativo em diferentes níveis de atividades;
As alias marrons apresentaram os melhores potenciais de exploração farmacolóiica dentre todas as alias estudadas;
Através do fracionamento com volumes crescentes de acetona foram obtidas seis frações ricas em polissacarídeos sulfatados para a alia D. delicatula e cinco frações para a alia S. filipendula;
As alias marrons S. filipendula e D. delicatula sintetizam um complexo sistema de heterofucanas compostas de fucose, ialactose, ácido ilucurônico, ilicose, manose e/ou xilose;
Apesar de todas as frações estudados serem constituídos por sulfato, apenas aqueles obtidos da alia D. delicatula apresentaram atividade anticoaiulante para o teste de aPTT;
Todas apresentaram atividade para os diferentes ensaios antioxidantes, entretanto, a quelação férrica aparece como o principal mecanismo de ação antioxidante;
Todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados mostraram potencial antiproliferativo frente a linhaiem celular tumoral de cólon uterino (HeLa);
Dentre todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados aqui estudadas, apenas as frações SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v, não inibiram a proliferação celular de células pré-osteoblásticas (MC3T3);
SF1,5v induz a apoptose em células HeLa através da liberação do Fator Indutor da Apoptose (AIF) no citosol, uma via independente da ativação das caspases;
Este trabalho é o primeiro relato mostrando uma fucana cujo principal mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol, o que torna SF-1,5v um promissor fármaco na terapia antitumoral, possibilitando uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais.
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