Sortere

Os leucócitos foram analisados nos olhos dos ratos controles e induzidos ao processo inflamatório por 24 (EIU 24h) e 48 horas (EIU 48h) sem tratamento. Outros animais foram induzidos à uveíte e tratados farmacologicamente com Ac2-26 por meio das administrações tópica (EIU/Ac2-26 tópico) e sistêmica (EIU/Ac2-26 sistêmico) e, ainda, com o peptídeo e Boc2 (EIU/Ac2-26/Boc2).

Nos olhos controles observamos ausência de leucócitos transmigrados nos segmentos anterior (figuras 7A e B) e posterior (figura 7C). Após 24 horas da inflamação intraocular com LPS ocorreu intenso influxo de leucócitos, principalmente neutrófilos, no segmento anterior do olho. Essas células foram observadas no HA, nas câmaras anterior e posterior e, também, no estroma da íris, corpo ciliar e processos ciliares (figuras 7D e E). Embora o processo inflamatório induzido pelo LPS tenha sido mais evidente no segmento anterior do olho, foi possível verificar alterações no segmento posterior. Nesse segmento, os neutrófilos foram observados extravasados no humor vítreo e na retina, principalmente na camada plexiforme interna (figura 7F).

A redução na transmigração dos neutrófilos no HA foi verificada após administração do Ac2-26 nos animais tratados por via subcutânea (15,83 ± 1,30, p<0,001) e instilações tópicas (19,00 ± 3,02, p<0,001) (figura 7M) quando comparamos ao grupo EIU 24h (55,67 ± 5,67). Nos tecidos oculares, também ocorreram reduções no número de leucócitos extravasados após os tratamentos sistêmico (204,0 ± 37,79, p<0,001) (figuras 7G-I e N) e tópico (313,0 ± 39,10, p<0,001) (figuras 7J-L e N) em relação à EIU 24h (747,8 ± 57,39). Entre os tratamentos, a diminuição na transmigração dos neutrófilos foi mais acentuada nos olhos dos animais que receberam Ac2-26 por via subcutânea.

A diminuição no número de células transmigradas após tratamentos farmacológicos foi semelhante àquela observada na EIU 48h, considerada fase de remissão do processo inflamatório. Os resultados dessa fase mostraram reduções significantes dos neutrófilos extravasados no HA (19,75 ± 3,79, p<0,001) (figura 7N) e tecidos oculares (192,7 ± 40,38, p<0,001) (figura 7M) comparadas à EIU 24h.

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As análises relacionadas com os efeitos do Boc2 (antagonista do receptor fpr2, na EIU), mostraram que a administração conjunta Ac2-26/Boc2 anulou a ação inibitória do peptídeo sobre o extravasamento de neutrófilos no HA (47,67 ± 4,47) e nos tecidos oculares (623,9 ± 45,77) (figuras 7M e N).

Figura 7. Análises histopatológicas dos tecidos oculares na EIU. Ausência de leucócitos nos tecidos controles (A-C). Influxo de neutrófilos (setas) na íris (D) processos ciliares (E) e retina (F) após LPS 24 h. Diminuição do extravasamento celular após tratamentos sistêmico (G-I) e tópico (J-L) com Ac2-26. Cortes: 1 μm. Barras: 10 μm. Análises quantitativas dos neutrófilos no humor aquoso (HA) (M) e nos tecidos oculares (N). Os dados mostram média ± SEM de neutrófilos x 105 mL e de neutrófilos/mm2, respectivamente no HA e tecidos oculares de ratos controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2- 26/Boc2) (n = 7 animais/grupo). *** p<0,001 e * p<0,05 versus controle, ††† _{p<0,001 versus EIU 24h,} ‡‡‡ _{p<0,001 e} ‡‡ _{p<0,01 versus EIU 48h,} §§§ _{p<0,001 versus EIU/Ac2-26 sistêmico,} ααα _{p<0.001 e} αα

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4.2. Administração do Ac2-26 reduz o extravasamento de proteínas e liberação de mediadores químicos na EIU

As proteínas totais nos sobrenadantes dos tecidos oculares após maceração foram analisadas nos olhos dos ratos em todos os grupos experimentais. Após 24 horas do processo inflamatório sem tratamento, ocorreu aumento significante nos níveis de proteínas totais (p<0,001) quando comparamos ao controle. Esses níveis foram menores na EIU 48h (p<0,001) e nos animais tratados com Ac2-26 pelas vias subcutânea (p<0,001) e tópica (p<0,05) em relação à fase inicial do processo inflamatório (figura 8A). Enquanto, no grupo EIU/Ac2-26//Boc2 a concentração de proteínas totais foi similar à EIU 24h (figura 8A), mostrando reversão dos efeitos inibitórios do peptídeo e aumento na permeabilidade vascular.

As citocinas IL-1β, IL-6, TNF-α e, o NO, moléculas multifuncionais que desempenham papel importante na defesa do hospedeiro nas reações inflamatórias de fase aguda, foram analisadas nos sobrenadantes dos tecidos oculares após maceração. Os resultados indicaram baixos níveis de IL-1β, IL-6, TNF-α e NO nos olhos dos animais controles e, como esperado, aumento na EIU 24h (p<0,001) (figuras 8B-E). Quando o peptídeo foi administrado pelas vias subcutânea ou tópica, ocorreram reduções nas concentrações de IL-1β (p<0,001 em ambos os tratamentos), IL-6 (p<0,01 no grupo sistêmico), TNF-α (p<0,001 no grupo sistêmico e p<0,05 no tópico) e NO (p<0,001 e p<0,01 sistêmico e tópico, respectivamente) comparadas à EIU 24h. Diminuições similares da secreção de citocinas e produção de NO foram observadas na EIU 48h, indicando a resolução temporal do processo inflamatório (figuras 8B-E). Diferentemente, no grupo EIU/Ac2-26/Boc2 observamos níveis dos mediadores químicos equivalentes à EIU 24h, com aumentos significantes de IL-1β (p<0,001), IL-6, TNF-α (p<0,01) e NO (p<0,001) em relação ao controle (figuras 8B-E).

Novamente, o tratamento subcutâneo foi mais eficiente, pois as reduções nas concentrações de proteínas totais e mediadores químicos inflamatórios foram mais acentuadas nesse grupo (figuras 8A-E).

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Figura 8. Efeitos do peptídeo Ac2-26 na EIU. Diminuição nos níveis de proteínas totais (A), inibição de IL-1β (B), IL-6 (C), TNF-α (D) e NO (E) nos olhos de ratos. Os resultados são expressos como média ± SEM de mg de proteínas/mL, pg de citocinas/mL e _{μM de NO nos sobrenadantes após} maceração dos tecidos oculares controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 6 animais/grupo). *** p<0,001, ** p<0,01 e * p<0,05 versus controle, ††† _p<0,001, †† _{p<0,01 e} † _{p<0,05 versus EIU 24h,} ‡‡ _{p<0,01 e} ‡

p<0,01 versus EIU 48h, §§§ p<0,001 e § p<0,05 versus EIU/Ac2-26 sistêmico.

4.3. A expressão da COX-2 na EIU é inibida após tratamentos com Ac2-26 e

exacerbada na presença do Boc2 e nos animais AnxA1-/-

Nos tecidos oculares dos ratos controles (figuras 9A-C) detectamos a expressão da COX-2 apenas na retina (figura 9C), onde é considerada constitutiva. Nos animais induzidos à uveíte não tratados (figuras 9D-F) e, após os tratamentos sistêmico (figuras 9G-I), tópico (figuras 9J-L) e Ac2-26/Boc2 (figuras 9M-O) observamos imunomarcação para COX-2 nos segmentos anterior e posterior. Não houve imunorreatividade no controle da reação (figura 9P).

As análises densitométricas revelaram aumento na expressão da COX-2 nos animais EIU 24h e 48h (p<0,001) comparados ao controle (figura 9Q) e, diminuição

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após os tratamentos sistêmico (p<0,001) e tópico (p<0,001) em relação à EIU 24h (figura 9Q). A imunorreatividade diminuída também foi observada nos tecidos oculares dos animais tratados sistemicamente comparada aos tópicos (p<0.05) e EIU 48h (p<0,001) (figura 9Q). Enquanto, os EIU/Ac2-26/Boc2 revelaram expressão aumentada da COX-2 (p<0,001) em relação aos tratados apenas com Ac2-26 (figura 9Q), mostrando reversão do efeito do peptídeo Ac2-26.

Figura 9. Expressão da enzima COX-2 nos tecidos oculares na EIU. Ausência de imunomarcação nos epitélios da córnea (A) e processos ciliares (B) e, fraca expressão na retina (C) nos olhos controles. Células epiteliais e nervosas mostrando intensa imunorreatividade para COX-2 na córnea (D), processos ciliares (E) e retina (F) após LPS 24 horas. Diminuição da expressão após os tratamentos sistêmicos (G-I) e tópicos (J-L) com Ac2-26 e, intensa após Ac2-26 e Boc2 (M-O). Ausência de imunorreatividade no controle da reação (P). Contracoloração: Hematoxilina. Barras: 10 μm. Análise densitométrica da COX-2 (Q). Os resultados foram obtidos como média ± S.E.M. do índice densitométrico dos olhos de ratos controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 7 animais/grupo). *** p<0,001 e * p<0,05 versus controle, ††† _{p<0,001 versus EIU 24h,} ‡‡‡ _{p<0,001 e} ‡‡ _{p<0,01 versus EIU}

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Os experimentos desenvolvidos com camundongos mostraram padrão de expressão da COX-2 semelhante ao observado nos tecidos oculares de ratos, com aumento da imunorreatividade nos selvagens EIU 24h (p<0,001) (figuras 10D-F e N) comparado aos selvagens controles (figuras 10A-C e N). Expressão elevada da COX-2 também foi observada nos AnxA1-/- EIU 24h (p<0,001) (figuras 10J-L e N) comparada aos AnxA1-/- controles (figuras 10G-I e N). As análises densitométricas revelaram inflamação exacerbada nos tecidos oculares dos AnxA1-/- EIU24h (p<0,01) em relação aos selvagens induzidos à uveíte (figura 10N). O controle da reação confirma a especificidade da COX-2 (figura 10M).

Figura 10. Superexpressão da COX-2 nos tecidos oculares de camundongos deficientes para AnxA1 (AnxA1-/-) na EIU. Ausência de imunorreatividade nos epitélios da córnea e processos ciliares nos grupos controles e, fraca expressão na retina dos animais selvagens (A-C) e AnxA1-/- (G-I). Expressão intensa nos animais selvagens (D-F) e AnxA1-/- (J-L) após LPS 24 h. Ausência de imunorreatividade no controle da reação (M). Contracoloração: Hematoxilina. Barras: 10 μm. Análise densitométrica da COX-2 (N). Os resultados foram obtidos como média ± S.E.M. do índice densitométrico dos olhos de camundongos controles selvagens e AnxA1-/- e, selvagens e AnxA1-/- induzidos à uveíte por 24 h (n = 3 animais/grupo). *** p<0,001 versus selvagem controle, ††† _p<0,001

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