6. AVSLUTNING
6.3 F ORSLAG TIL VIDERE FORSKNING
Eick et al.37 (2004) utilizaram em seu estudo biofilmes de
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococcus constellatus e Porphyromonas gingivalis. O crescimento dos biofilmes foi feito em lâminas cobertas com saliva artificial, por até 48 horas. Os resultados demonstraram que os antibióticos clindamicina, doxiciclina, metronidazol e moxifloxacin não penetraram completamente no biofilme. Segundo os autores, a erradicação completa do biofilme por meio do uso de antibióticos é improvável, levando em conta as altas concentrações inibitórias mínimas necessárias para a eficácia antibacteriana.
Kishen et al.68 (2006) investigaram a interação entre o E.
faecalis e o substrato dentinário. Blocos de dentina foram incubados com E. faecalis durante intervalos de 2, 4 e 6 semanas. O meio de cultura era trocado a cada 48 horas. Após o período de incubação, a composição química do biofilme foi analisada por meio da Difração de Raios-x e da Espectroscopia do Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIV). Em outro grupo de amostras foi incubado durante seis semanas com E. faecalis e a morfologia e a ultra-estrutura do biofilme foi examinada usando o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV), Microscópio Óptico, e Microscópio Confocal. Por meio do MEV os autores observaram a formação do agregado celular na superfície dentinária e características de dissolução da matriz dentinária após uma semana de incubação. Após duas semanas, os agregados tendem a coalescer formando agregados maiores na superfície dentinária. A superfície dentinária a partir desse momento passa a apresentar típica aparência de corrosão. Após 3, 4 e 6 semanas o biofime apresenta-se mais maduro e com estruturas mais altas. A Microscopia Confocal demonstrou áreas de células mortas e no interior do biofilme áreas de células vivas. Foi ainda demonstrada uma possível presença de carbonato de cálcio calcificado pelo FTIV.
George et al.43 (2005) estudaram o efeito de diferentes condições de crescimento nas características do biofilme de E. faecalis, e a penetração destes microrganismos nos túbulos dentinários, uma vez que muito se fala das condições favoráveis ao crescimento do E. faecalis após o tratamento endodôntico. A cultura do biofilme foi feita sobre blocos de dentina em aerobiose, anaerobiose, com riqueza de nutrientes e com deficiência de nutrientes por um período de 21 dias. A análise dos biofilmes foi realizada com Microscopia Eletrônica de Varredura, Microscopia Confocal e Raios-X de Energia Dispersiva (EDX). A penetração das bactérias nos túbulos dentinários foi observada por meio da Microscopia Ótica com coloração de Gram. O EDX demonstrou um aumento significante dos níveis de cálcio (Ca+) na estrutura do biofilme
formado sob condições anaeróbicas e com deficiência de nutrientes. A profundidade de penetração das bactérias foi maior quando o ambiente foi rico em nutrientes.
Clegg et al.21(2006) inocularam amostras de cultura colhidas
de canais radiculares de dentes com necrose pulpar, em blocos de dentina. Os espécimes foram imersos nas soluções teste (MTAD®,
clorexidina e hipoclorito de sódio) e foram avaliados em Microscopia Eletrônica de Varredura, e também por meio da cultura de raspas de dentina. O hipoclorito de sódio a 6% e a 3% foi capaz de romper e de eliminar o biofilme bacteriano; enquanto o NaOCl a 1% seguido do MTAD® por 5 minutos foi capaz de romper, mas não de eliminar as
bactérias; e a clorexidina a 2% não conseguiu romper o biofilme. Na metodologia de cultura, não houve crescimento nos espécimes expostos ao NaOCl a 6%, clorexidina a 2% e NaOCl a 1% seguido do MTAD®.
avaliaram a efetividade antimicrobiana do hipoclorito de sódio a 6%, 3% e 1%, da clorexidina a 2%, e do MTAD®.
Sena et al.126 (2006) desenvolveram um modelo de biofilme in vitro para investigação do efeito do NaOCl e da clorexidina gel sobre
biofilmes de monoculturas de E. faecalis, S. aureus, C. albicans, P. intermédia, P. gingivalis, P. endodontalis e F. nucleatum. Os biofilmes foram gerados em filtros de membrana de celulose e incubados em placas de BHI ágar para os facultativos e aeróbios e FAA (Ágar Anaeróbio Fastidioso) para os microrganismos anaeróbios. A eficiência do método para criação do biofilme foi verificada em MEV após 10 dias de incubação. Os filtros de membrana foram retirados do meio de cultura e colocados em contato com as soluções a serem avaliadas por períodos de 5, 10, 15, 30 e 60 minutos. Após os períodos de tempo determinados a ação do hipoclorito foi neutralizada com tiossulfato de sódio e a da clorexidina com a associação de a-lecitina e Tween 80. As células bacterianas viáveis foram suspensas, e após a diluição seriada foi feita cultura em placas de ágar para posterior contagem das UFC. Os agentes utilizados na forma líquida demonstraram melhor ação antimicrobiana no biofilme. Além disso, os microrganismos anaeróbios foram eliminados mais rapidamente que os facultativos e aeróbios.
Soukos et al.143 (2006) utilizaram um modelo in vitro de biofilme de E. faecalis para avaliação da terapia fotodinâmica sobre microrganismos presentes em infecções endodônticas. Uma suspensão de E. faecalis foi feita em meio BHI onde foram incubados segmentos de dentina radicular durante três dias em ambiente anaeróbio. Após o tratamento da dentina, os segmentos de canal radicular foram irrigados com meio BHI e o conteúdo dessas amostras foram agitadas em um vortex, foram realizadas diluições seriadas. As amostras foram incubadas após plaqueamento em ágar sangue, em ambiente anaeróbio por sete dias. A terapia fotodinâmica foi capaz de eliminar até 97% das bactérias viáveis do biofilme.
Em 2006, Rolland et al.120 observaram a formação do
biofilme na superfície de adesivos dentinários aplicados à superfície de blocos de dentina. Uma das superfícies dos blocos de tecido dentinário
não receberam aplicação dos adesivos. Os espécimes foram incubados em saliva colhida de voluntários, e suplementada com sucrose, a 37oC
durante nove dias. O meio de cultura era renovado a cada 24 horas. O biofilme foi observado no Microscópio Confocal após ser corado com o Live: Dead Baclight Bacterial Viability Stain (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). Imagens foram capturadas a cada 2 µm de profundidade do biofilme e a análise do percentual de células vivas e mortas foi realizada em três diferentes profundidades do biofilme. Os autores afirmam que a coloração fluorescente de bactérias viáveis e não-viáveis e o Microscópio Confocal permitem a observação e a quantificação eficazes dos microrganismos presentes no biofilme.
Robinson et al.118 (2006) observaram por meio do Microscópio Confocal o efeito do ambiente na arquitetura do biofilme. Amostras de placa bacteriana foram colhidas de voluntários, transferidas para meio de transporte reduzido (RTF) e levados ao Microscópio Confocal. Os níveis de cinza observados em níveis de 1 a 9 foram classificados como indicativos da densidade da biomassa. Foram aplicados ao biofilme: manipulação mecânica, força iônica, diminuição do pH e um surfactante e novamente observadas as imagens no Microscópio Confocal. No geral, o biofilme era denso, e foi pouco afetado pela manipulação mecânica, força iônica e baixo pH (2,5). Apenas a aplicação do surfactante parece ter removido parte da biomassa e dramaticamente reduzir a densidade do biofilme.
Dunavant et al.35 (2006) utilizaram uma nova metodologia in
vitro, para o crescimento de biofilme, onde o este era incubado em um sistema de fluxo celular e posteriormente submerso nas soluções a serem avaliadas por 1 ou 5 minutos. Foram avaliados o hipoclorito de sódio a 1% e 6%, MTAD®, clorexidina a 2%, REDTA e SmearClear. O efeito de cada
solução foi determinado pela contagem da porcentagem de células bacterianas mortas em relação às bactérias viáveis. Não houve diferença
estatisticamente significante com relação ao tempo de ação das substâncias avaliadas. Os autores afirmaram ser esta metodologia eficaz para o crescimento do biofilme e para a avaliação da ação de medicamentos sobre o biofilme.
A Microscopia Confocal foi utilizada por Van der Mei et al.161 (2006) para verificar a ação antimicrobiana de um enxaguante bucal e de um dentifrício sobre o biofilme. Voluntários participantes da pesquisa forneceram amostras de biofilme formadas durante 72 horas na cavidade bucal com e sem tratamento com os dentifrícios e enxaguantes avaliados. Após os testes, o biofilme foi colhido e corado com Live/Dead Baclight stain (Molecular Probes, Europe BV) e analisando no Microscópio Confocal. Os autores afirmam ser esta metodologia promissora para a avaliação de agentes antimicrobianos in vivo e in situ.
Yang et al.170 (2006) utilizaram a fluorescência quantitativa e
a Microscopia Laser Confocal para estudar a formação in vitro de biofilme analisando sua estrutura e seus componentes. Além disso, observaram a ação dos antibióticos amoxicilina, doxiciclina, eritromicina, metronidazol e vancomicina além de substancias como a clorexidina, o etanol e o lauril- sulfato de sódio sobre a estrutura do biofilme. O crescimento do biofilme em anaerobiose resultou em uma maior produção de substancia extracelular polimérica e carboidratos do que quando o biofilme foi produzido em aerobiose. Além disso, a adição de sucrose igualmente contribuiu para a maior formação de matriz extracelular, e maior concentração de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos. Após exposição do biofilme por 30 minutos às substâncias avaliadas, foi observada inibição de diferentes componentes do biofilme. Os resultados indicaram uma relação dose-dependente da substancia avaliada sobre a inibição do biofilme.
O Microscópio Laser Confocal foi utilizado por Khemaleelakul et al.66 (2006) para observação do biofilme formado por
bactérias isoladas de infecções endodônticas agudas quanto à sua auto- agregação celular. Também toda possível combinação de duas espécies bacterianas da mesma amostra clínica foi avaliada quanto à co- agregação. De 10 amostras clínicas foram isoladas 62 espécies bacterianas, e a auto-agregação foi verificada em 56.45% das espécies. A co-agregação foi verificada em 29 dos 183 pares avaliados. Os autores afirmam que a Microscopia Confocal é um método bastante sensível para detectar agregação bacteriana.
Duggan, Sedgley34 (2007) observaram a formação de
biofilmes pelo E. faecalis colhido de diferentes sítios. Foram avaliadas 70 espécies colhidas da cavidade bucal, dos canais radiculares e de outras fontes não-orais. A incubação dos biofilmes foi feita em meio TSB (Tryptic Soy Broth) por 24 horas a 37oC em aerobiose. O crescimento do biofilme foi verificado após coloração com cristal violeta e análise da absorbância por um espectrofotômetro. Os autores não conseguiram demonstrar diferença significante entre os grupos com relação à capacidade de formação de biofilme.
Walker, Sedlacek165 (2007) desenvolveram um modelo de
biofilme da placa subgengival em discos de hidroxiapatita. Os discos foram cobertos por saliva, incubados em TSB, e inoculados com uma suspensão de placa subgengival. O biofilme foi incubado em ambiente anaeróbio e o meio de cultura renovado a cada 48 horas até o período máximo de até 10 dias. O modelo permitiu o crescimento de um biofilme maduro, multi-espécies, heterogêneo, com microrganismos Gram- positivos e Gram-negativos. As espécies presentes no biofilme e suas proporções eram compatíveis com a composição da placa subgengival.
Dige et al.33 (2007) utilizaram a Microscopia Confocal em conjunto com a hibridização in situ por fluorescência para analisar a formação do biofilme. Os biofilmes foram coletados de aparatos intra- bucais utilizados por voluntários por 6, 12, 24 e 48 horas. As amostras permitiram a diferenciação de Streptococcus de outras bactérias e a determinação da sua distribuição no biofilme. Os resultados deste tipo de metodologia permitiram um melhor entendimento da estrutura do biofilme, mostrando uma organização semelhante a pequenos vulcões e distribuição em múltiplas camadas.
Thein et al.154 (2007) estudaram o desenvolvimento de Candida albicans e não-albicans em biofilme com diferentes condições ambientais. A cultura dos biofilmes foi realizada em placas de cultura celular de poliestireno, utilizando 10 diferentes cepas de isolados clínicos de Candida em aerobiose e em anaerobiose. Foi realizado o teste de proliferação celular com reagente XTT e analise morfológica do biofilme foi feita por meio do MEV. A morfologia do biofilme variou de acordo com as condições de crescimento do biofilme. A espécie C. albicans produziu um biofilme com múltiplas camadas compactas, envolto em matriz extracelular em aerobiose e condições dinâmicas, com movimentação de fluido durante o tempo de incubação.
Sedlacek, Walker123 (2007) utilizaram um modelo in vitro de biofilme subgengival para avaliar o efeito de antibióticos sobre o biofilme. A cultura de biofilmes foi feita em discos de hidroxiapatita em meio TSB de 4 horas a 10 dias e então expostos a diferentes tipos de antibióticos por 48 horas. As concentrações de antibiótico necessárias para inibir os microrganismos organizados no biofilme foram até 250 vezes maiores que as concentrações necessárias para inibir os microrganismos na forma planctônica. Além disso, os autores concluíram que a resistência do biofilme está relacionada com o tempo de crescimento do mesmo, sendo
que a máxima resistência é alcançada na fase estacionária do crescimento celular bacteriano.
Giardino et al.47 (2007) avaliaram a ação do hipoclorito de
sódio, MTAD®, e Tetraclean®sobre o E. faecalis organizado na forma de
biofilme. A cultura do biofilme foi realizada em filtros de membrana de celulose sobre placas de ágar BHI, incubadas por 48 horas a 37oC em
aerobiose. A formação do biofilme foi constatada por meio do MEV. Para avaliação das soluções, as membranas contendo o biofilme foram transportadas para tubos contendo as soluções irrigadoras. Após o período experimental, as soluções foram neutralizadas com meio neutralizante (D/E Neutralizing Broth, Difco, CO), e foi utilizado o vortex durante 60 segundos para a suspensão das células bacterianas. Diluições seriadas foram realizadas para cultura nas placas de ágar e contagem do número de UFC após incubação por 48 horas.
Özok et al.101 (2007) compararam o crescimento do
Fusobacterium nucleatum e do Peptostreptococcus micros em biofilme de monoespécie e misto. Além disso, verificaram a suscetibilidade dos mesmos a diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. O crescimento dos biofilmes foi realizado em anaerobiose a 37oC, em placas
para cultura de células em poliestireno com meio PYG (Peptone Yeast Glucose) durante 24 ou 96 horas. O crescimento do biofilme foi verificado por meio da leitura da absorbância de luz em um spectrofotômetro após coloração com cristal violeta. Após o tratamento antibacteriano com as diferentes concentrações de NaOCl foram realizadas diluições seriadas e cultura em placas de ágar sangue. As UFC foram calculadas após três ou quatro dias de incubação das placas. Os resultados apontaram um aumento da resistência do biofilme ao NaOCl quanto mais maduro o biofilme. Além disso, quando combinadas as duas espécies no biofilme, este se tornou mais resistente do que quando em monoespécie.
Müller et al.89(2007) usaram discos de dentina bovina como substrato para o biofilme formado por seis espécies: Actinomyces naeslundii, Veillonella díspar, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sobrinous, S. oralis e Candida albicans. Os discos de dentina receberam uma cobertura de saliva previamente à incubação dos microrganismos com meio mFUM (Modified Fluid Universal Medium), em anaerobiose por até 64,5 horas. Passado este período os biofilmes foram tratados com aplicação de ozônio, laser de baixa intensidade, clorexidina ou hipoclorito de sódio. A análise dos resultados foi feita após suspensão das células do biofilme, diluições seriadas e cultura em ágar sangue. O NaOCl a 5% e a clorexidina foram capazes de eliminar completamente os microrganismos do biofilme, enquanto o laser e o ozônio tiveram pouca atuação sobre o mesmo.
Folkesson et al.42 (2008) avaliaram como a estrutura do
biofilme afeta a susceptibilidade dos microrganismos aos antibióticos. Os autores desenvolveram biofilmes de Escherichia coli com diferentes estruturas organizacionais. Após o crescimento os biofilmes foram tratados com colistina e o ciprofloxaxin. A morte celular foi verificada por meio da contagem de células viáveis e da Microscopia Confocal. A maior tolerância do biofilme à colistina se deu graças a uma modificação genética que induz mecanismos de tolerância específicos e não a uma propriedade geral do biofilme. Nenhuma das espécies foi resistente ao ciprofloxacin.
Brändle et al.14(2008) avaliaram o efeito do estresse alcalino
no biofilme. Enterococcus faecalis, Streptococcus sobrinus, Candida albicans, Actinomyces naeslundii e Fusobacterium nucleatum foram incubados em blocos de dentina em biofilmes mono- e multi-espécies, em ambiente anaeróbio durante cinco dias. A adesão à dentina conferiu ao E. faecalis e ao A. naeslundii maior resistência ao hidróxido de cálcio. A
interatividade entre as espécies também aumentou a resistência dos microrganismos à alcalinidade promovida pelo hidróxido de cálcio.
Norrington et al.97(2008) cultivaram biofilmes sobre fatias de
2 mm de dentina humana. Amostras colhidas de canais radiculares com polpas necróticas foram utilizadas para a cultura de biofilmes em ambiente anaeróbio por 12 dias. O meio de cultura foi trocado a cada quatro dias para garantir nutrientes para as células bacterianas. Após o contato dos biofilmes com antibióticos, diariamente, durante oito dias, os espécimes foram observados por meio de MEV. Nenhum dos antibióticos avaliados foi eficaz na eliminação do biofilme.
3 Proposição
Os objetivos deste estudo foram:
1. avaliar a ação antibacteriana das soluções Tetraclean®,
MTAD® e quatro modificações desta formulação, sobre uma cepa de Enterococcus faecalis (VP3-181) por meio do método de contato direto;
2. avaliar a ação das soluções Tetraclean®, MTAD® e quatro
modificações desta formulação frente um modelo de biofilme anaeróbio, desenvolvido in vitro.