Atualmente, muitos antibióticos e antifúngicos estão se tornando ineficazes para o tratamento de infecções e o número de fármacos disponíveis no mercado para tratá-las é bastante limitado. A resistência apresentada por micro-organismos também impulsionaram pesquisas na busca por agentes microbianos mais eficientes (FERREIRAet al., 2012).
Fungos do gênero Aspergillus têm uma sólida contribuição na produção de metabólitos biologicamente ativos, tais como antifúngicos, anticolinesterásicos, anticancerígenos, entre outros (WUet al., 2010; NEWMAN; CRAGG, 2012; MATHANet al., 2013). Além de determinar condições ótimas para produção de ácido kójico (51) e para diversificação metabólica, outra perspectiva de
43 estudo neste trabalho consistiu em encontrar condições para a produção de extratos fúngicos com atividades biológicas.
Os extratos obtidos foram testados frente aos micro-organismos C. albicans, A. flavus, S. aureus e E. coli.Com os resultados dos testes realizaram-se cálculos estatísticos (item 4.8, p.51) a fim de encontrar os parâmetros relacionados à atividade biológicaapresentada.
Gráficos de superfície de resposta referentes ao planejamento fatorial 22 (Meios de cultivo CYA e YES) e 23 (Meios de cultivo LCG e LCS) foram traçados em função da atividade antimicrobianae permitiram selecionar as melhores condições de cultivo que apresentaram atividade e o respectivo micro-organismo contra o qual este extrato foi ativo (TAB. 6).
Tabela 6-Tempos de cultivo, interações entre as variáveis que apresentaram influência na atividade biológica, micro-organismos para os quais esta influência foi significativa (p ≤ 0,05) e melhor condição encontrada para o cultivo
Códigos dos experimentos
Tempo de
cultivo (dias) Interação estudada
Micro- organismo Melhor condição encontrada* PMB01 6 Agitação x meio (CYA / YES) E. coli
S. aureus YES sob agitação
PMB02 9 Agitação x concentração do carboidrato C. albicans LCG150 sem agitação PMB03 LCS150 sem agitação PMB04 12 Agitação x concentração do carboidrato E. coli LCG150 sob agitação PMB05 LCS150 sob agitação PMB06 15 Agitação x Meio (LCG / LCS) E. coli LCG20 sem agitação PMB07 LCG150 sem agitação PMB08 21 Agitação x concentração do carboidrato S. aureus LCG150 sem agitação PMB09 LCS150 sem agitação PMB10 24 Agitação x concentração do carboidrato x Meio (LCG / LCS)
A. flavus LCG20 sem agitação
PMB11 E. coli
C. albicans LCG20 sob agitação
PMB12 27 Agitação x Meio (LCG / LCS) A. flavus C. albicans S. aureus LCG20 sob agitação PMB13 LCG150 sob agitação *itens 4.3 (p. 48) e 4.8 (p. 51)
A FIG. 29 (p. 41) ilustra o gráfico desuperfície de resposta (planejamento fatorial 2²) para atividade antimicrobiana,no qual foi avaliada a interação entre o tipo de meio e a agitação, de extratos preparados após seis dias de cultivo (PMB01,TAB. 6). Os valores máximos referentes aos eixos Y e X, foram previamente selecionados a partir do planejamento fatorial 2², conforme pode ser visualizado na
44 TAB. 9 (p. 52). Nos gráficos A e B (FIG.29, p.41) observou-se um aumento na porcentagem de inibição contra E. coli e S. aureus, demonstrado pela coloração no sentido verde-vermelho, sendo possível visualizar nas legendas as porcentagens de inibição e suas respectivas colorações.Os demais gráficos encontram-se no (APÊNDICE N-X, p. 162-168). Pode-se notar que as condições ótimas encontradas nesta fase do processo fermentativo ocorreram com o meio de cultivo YES (valores altos para eixo Y) na presença de agitação (valores altos para X).
Figura 29- Superfície de resposta para atividade biológica apresentada pelos extratos frente aos micro- organismos E. coli (GRAF. A) eS. aureus (GRAF. B) em função do meio e da agitação, para o tempo de 6 dias de cultivo
Como grandes quantidades de ácido kójico (51) foram obtidas através da fermentação doA. parasiticus,a atividade deste metabólito foi determinada contra todos os micro-organismos alvos deste estudo (GRAF. 4) e quantificadas em todos os extratos (TAB. 7, p. 42).
Gráfico 4- Representação gráfica da porcentagem de inibição apresentada pelo ácido kójico (51) na concentração de 250µg mL-1 frente aos micro-organismosA. flavus, C. albicans, E. coli e S. aureus
45 O ácido kójico (51) apresentou atividade moderada contra todos os micro-organismos testados nas condições utilizadas neste estudo, variando de 45,6 ± 0,1% contra C. albicans até 63,7 ± 3,8 % em relação a S. aureus(GRAF. 4, p. 41). Por conseguinte, se a atividade biológica dos extratos estivesse relacionada apenas com a presença de ácido kójico (51), o extrato que apresentasse maior porcentagem deste metabólito, também deveria apresentar maior percentagem de inibição de crescimento microbiano, quando comparado com os extratos que contivessem quantidades mais baixas de ácido kójico(51). No entanto, os ensaios com os extratos brutosmostraram que a maioria deles apresentou taxas de inibição superior à de ácido kójico (51), como mostrado na TAB. 7.
Tabela 7-Porcentagens de inibição contra A. flavus, C. albicans, E. coli e S. aureus para os extratos, com suas respectivasporcentagens de ácido kójico (51)
Código Micro-organismo Porcentagem de inibição (%) Ácido kójico (51) (%)
PMB01 E. coli 50,4 ± 0,9 0,04 S. aureus 50,6 ± 4,7 PMB02 C. albicans 53,0 ± 0,1 26,30 PMB03 54,7 ± 7,5 37,94 PMB04 E. coli 64,0 ± 0,8 35,38 PMB05 64,2 ± 6,6 34,55 PMB06 E. coli 69,8 ± 1,0 18,52 PMB07 54,6 ± 1,8 29,28 PMB08 S. aureus 52,2 ± 2,3 34,14 PMB09 49,2 ± 0,5 57,70 PMB10 A. flavus 41,1 ± 0,7 15,53 PMB11 E. coli 53,6 ± 4,9 10,23 0 20 40 60 80 100 % D E IN IBIÇÃ O MICRO-ORGANISMO
PERFIL ANTIMICROBIANO DO ÁCIDO KÓJICO (51)
46 C. albicans 62,7 ± 1,4 PMB12 A. flavus 49,8 ± 3,2 7,66 C. albicans 60,2 ± 0,7 S. aureus 57,7 ± 1,0 PMB13 A. flavus 49,7 ± 3,2 41,10 C. albicans 58,4 ± 4,3 S. aureus 64,0 ± 1,7
O extrato obtido a partir da condição PMB01(TAB. 7)mostrou atividade contra os micro- organismos E. coli e S. aureus (50,4 ± 0,9% e 50,6 ± 4,7%, respectivamente) a níveis que não estão consistentes com a porcentagem de ácido kójico (51)(0,04%) presente no extrato, demonstrando a presença de outros metabólitos antimicrobianos. A presença de diferentes metabólitos nos extratos foi confirmada no seu perfilcromatográfico (FIG. 30).
Figura 30- Cromatograma obtido por CLAE-DAD em comprimento de onda de 270 nm, referente ao extrato fúngico proveniente do cultivo no meio YES por seis dias, sob agitação (PMB01)
O mesmo ocorreu para os extratos obtidos nas condições PMB11 e PMB12 que, apesar de produzirem pequenas quantidades de ácido kójico (51) (10,23 e 7,66%, respectivamente) apresentaram alta inibição dos micro-organismos testados (TAB. 7, p. 42). Através do cromatograma ilustrado na FIG. 31 (p. 44), referente aos extratos obtidos sob estas condições, foi possível verificar a presença de diferentes metabólitos secundários. Esses podem ser responsáveis pela atividade apresentada pelo extrato. A presença de metabólitos diferentes nos dois extratos está condizente, uma vez que estes extratos apresentaram atividades antimicrobianas distintas (TAB. 7, p. 42).
47 A literatura corrobora que a alteração da fonte de carbono no meio produz variação da atividade biológica. Por exemplo, extratos obtidos utilizando sacarose como fonte de carbono apresentaram atividade biológica mais elevada contra os micro-organismos, tais como E. coli e Fusarium oxysporum, quando comparado com extratos de meios de cultura contendo apenas glicose ou frutose (EL-AASAR, 2006). Fungos endófitos Apiospora montagneie Arthrinium statetambém produziram extratos com elevada atividade biológica, quando cultivadas em meios contendo sacarose como fonte de carbono (RAMOS; SAID, 2011). Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que a atividade biológica foi influenciada não só pela fonte de carbono disponível mas por outros fatores, tal como o tempo de cultivo (TAB. 6, p. 40).
Figura 31- Cromatograma obtido por CLAE-DAD em comprimento de onda de 270 nm, referente ao extrato fúngico proveniente do cultivo no meioLCG, sem agitação, durante 24 dias (A- PMB11) e 27 dias (B- PMB12)
48 Os extratos obtidos PMB02 e PMB08 foram preparados utilizando o mesmo meio de cultivo, porém com durações diferentes, sendo nove e 21 dias, respectivamente. Estes extratos apresentaram atividade biológica diferenciada (C. albicans e S. aureus, respectivamente) indicando que osmetabólitos responsáveis pela atividade biológica referente no extrato obtido da fermentação com nove dias de duração são diferentes daqueles presentes no extrato com 21 dias de cultivo. Este fato também foi observado para os extratos obtidos sob as condições PMB03 e PMB09.
Os resultados dos ensaios biológicos foram muito encorajadores, especialmente aquele obtido pela fermentação doA. parasiticussob condiçãoPMB01 que, além de apresentar atividade relevante contra as bactériasE. coli e S. aureus, foi o que apresentou a menor produção de ácido kójico (51). Utilização do meio LCG20, sem agitação, mostrou ser a condição mais adequada (69,8 ± 1,1% de inibição) para a produção de metabólitos ativos contra E. coli. Entre as condições fúngicas avaliadas para a produção de metabólitos bioativos, o extrato produzido sob a condição PMB10 mostrou
A
49 seletividade para o fungo A. flavus (41,1 ± 0,7% de atividade). As condiçõesPMB02 e PMB03 forneceram extratos seletivos contra o fungo C. albicans (53,0 ± 0,1 e 54,7 ± 7,5%, respectivamente). Estes resultados demonstram o grande potencial para a produção de metabólitos bioativos sob condições específicas.
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