Experimentos realizados por Bentley (2006) com três cepas de A. oryzae-flavus e sete cepas de A. oryzae, nos quais foi utilizada glicose (62), com um carbono do anel pirano marcado com o isótopo radioativo natural 14C, mostraram que o ácido kójico (51) produzido pelos fungos apresentou a mesma quantidade de carbonos marcados que a glicose (62). Estes resultados indicaram a existência de uma rota biossintética de conversão direta da glicose(62)em ácido kójico (51), sem que seja necessária a quebra do anel pirano, conforme pode ser visualizado na Equação 2(BENTLEY, 2006).
Equação 2-Proposta de biossíntese do ácido kójico (51), utilizando glicose (62) como fonte de carbono
A
32 Visto que esta rota biossintética do ácido kójico (51) parte da glicose (62), a quantidade deste reagente disponível no meio pode afetar qualitativa e quantitativamente a produção de ácido kójico (51). Este efeito foi estudado pela substituição da glicose (62) pela sacarose (63) em alguns experimentos. A conversão de 63 em 62 pela ação da enzima invertase é mostrada na Equação 3.
Equação 3- Conversão da sacarose (63) em D-glicose (62) e D-frutose (64) catalisada pela enzima invertase
O ácido kójico (51) foi identificado nos extratos a partir da comparação do tempo de retenção observado no cromatograma (9,28 min) e do espectro no ultravioleta armazenados no aplicativo Class LC-10, com os picos dos cromatogramas dos extrados fúngicos, no comprimento de onda de 270 nm.
A porcentagem de ácido kójico (51) presente nos extratos foi determinada utilizado o método de padronização externa.A curva de calibração construída pode ser visualizada no GRAF. 3 (p.30). O procedimento de ajuste da reta foi realizado pelo método de regressão linear. A equação da reta determinada foi y=139.419.507,07x – 2.992.550,64 e o coeficiente de correlação r2 = 0,99.
Gráfico 3- Curva de calibração obtida a partir da relação entre área sob a curva dos picos presentes nos cromatogramas e concentração ([ ]) de ácido kójico (51) em mg mL-1
33 Uma vez quantificado o rendimento de ácido kójico (51) nos extratos,realizaram-se cálculos estatísticos (item 4.8, p.51), a fim de determinar a melhor condição de cultivo para sua produção. Os tempos de cultivo, nos quais as interações entre as variáveis (tipo de meio de cultura e agitação) apresentaram influência na produção de ácido kójico (51), estão representados na TAB. 4.
Tabela 4- Tempos de cultivo, interações entre as variáveis que apresentaram influência significativa (p ≤ 0,05), melhor condição encontrada para o cultivo e porcentagem de ácido kójico (51) determinada no extrato
Tempo de cultivo
(dias) Interação estudada
Melhor condição encontrada
Ácido kójico
(%) Códigos
6 Agitação x Meio
(CYA / YES) YES sem agitação 61,4 PAK01 12
Agitação x concentração do carboidrato x Meio
(LCS / LCG)
LCS150 sem agitação 65,4 PAK02
15 Concentração do carboidrato x Meio (LCG / LCS)
LCS150 sem agitação 65,2 PAK03 LCS150 com agitação 46,6 PAK04 30 Agitação x Meio
(LCG / LCS)
LCG20 sem agitação 16,6 PAK05 LCG150 sem agitação 46,9 PAK06
Para as interações que apresentaram resultados significativos foram traçados gráficos de superfície de resposta referentes à alterações realizadas nas condições de cultivo, a fim de analisar o efeito destas sobre a produção de ácido kójico (51) nos diferentes extratos fúngicos obtidos (APÊNDICE C-E, p. 156-157), conforme metodologia descrita no item 4.8 (p. 51).
34 A FIG. 20apresentagráficos de superfície de resposta para o planejamento fatorial 2³, no qual as interações entre a fonte de carbono utilizada versus agitação (GRAF. A), a concentração do carboidrato versus agitação (GRAF. B) e a concentração do carboidrato versus o tipo de carboidrato (GRÁF. C), em cultivos processados em12 dias, apresentaram resultados significativos.
Figura 20- Gráficos de superfície de resposta para a porcentagem de ácido kójico (51) produzida em 12 dias de cultivo em função das variáveis agitação, tipo de carboidrato e concentração
Observou-se que, a produção de ácido kójico (51) é crescente no sentido da coloração verde- vermelha visualizadas nos gráficos de superfície de resposta (FIG. 20), sendo a produção de ácido kójico (51) indicada nas legendas com as respectivas colorações. Os valores máximos referentes aos eixos Y e X, foram previamente selecionados a partir do planejamento fatorial 2³, conforme pode ser visualizado na TAB. 8 (p. 51). Observou-se ainda que, no gráfico A (FIG. 20, p. 31) quando a sacarose (valores altos para o eixo X) foi utilizada em cultivos na ausência de agitação (valores baixos para o eixo Y), houve um aumento na produção de ácido kójico (51), já o gráfico B (FIG. 20, p. 31)indicouque os carboidratos presentes no meio de cultivo devem apresentar altas concentações
35 (valores altos para o eixo X) para maximizar a produção de ácido kójico (51).Através do gráfico C (FIG. 20, p. 31) foi possível verificar que a produção de ácido kójico (51) foi favorecida quando empregou-se sacarose em altas concentrações (valores altos para o eixo Y e X). Portanto, os melhores rendimentos de ácido kójico (51) no tempo de 12 dias devem associar altas concentrações de sacarose à ausência de agitação, situação descrita pela condição PAK02(TAB. 4, p. 30). A glicose é essencial para a produção do ácido kójico (51) (EL-AASAR, 2006; BENTLEY, 2006) e realmente o meio de cultura LCS disponibiliza maior quantidade de glicose (a partir da hidrólise da sacarose) para o fungo.
Entre os meios de cultura avaliados (YES, CYA e LC) pode-se concluir que o melhor meio para a produção de ácido kójico (51) foi o meio LCS150 (65,4 % de rendimento m/m), descrito pela condição PAK02 (TAB. 4, p. 30). Todos os meios de cultivo que apresentaram produção de ácido kójico (51) superior a 60 %, empregaram sacarose (alta concentração - 150 g L-1) como fonte de carbono, sem aeração durante a fermentação. Não foi constatada produção de ácido kójico (51) na maioria dos extratos obtidos quando se empregou o meio de cultura CYA, o que está em conformidade com os dados da literatura, que indicam uma produção ótima deste metabólito em um faixa de pH entre 2-7 (MOHAMAD et al., 2010). Conforme pode ser visualizado no GRAF. 2 (p. 23), o meio de cultivo CYA, tanto na ausência quanto na presença de agitação, apresentou pH > 7 durante a maioria dos tempos de cultivo.
Utilizando A. parasiticus El-Aasar, em 2006 obteve o melhor rendimento (34,4 g L-1) na produção de ácido kójico (51), empregando glicose em detrimento da sacarose, e extrato de malte em detrimento da peptona, na presença de agitação. No presente estudo, a utilização de peptona como fonte de nitrogênio mostrou-se mais eficiente que a utilização de extrato de levedura e extrato de malte.Dentre os meios com melhor rendimento (>60%) o meio YES, em que se utilizou extrato de malte como fonte de nitrogênio, apresentou a menor produção de ácido kójico (51) (61,4 %), conforme pode ser visualizado na TAB. 4 (p. 30).
O melhor rendimento de ácido kójico (51) alcançado neste trabalho foi aproximadamente 65 % m/m, superior ao rendimento encontrado, aproximadamente 1 %, por Kharchenko e Kuts (1999) na produção deste composto a partir de espécies de Aspergillus, utilizando grãos como meio de cultivo.Alguns trabalhos relatam excelentes rendimentos em g L-1, aproximadamente 40 g L-1 (WAN et al, 2005; EL-AASAR, 2006; ROSFARIZAN; ARIFF, 2007; MOHAMAD et al., 2010; FERREIRAet al., 2010).Porém nestes casos, o meio foi analisado como um todo, enquanto que, no presente trabalho,o ácido kójico (51) foi quantificado apenas na fase orgânica.Sendo o ácido kójico
36 (51)solúvel em água, é de se esperar que o rendimento obtido para este metabólito tenha sido sub- estimadono presente trabalho (7,4 g L-1).
3.3 Otimização das condições de fermentação para diversificação metabólica pelo fungo A.