Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet (NTNU) og SINTEF
Delrapport 3. SINTEF rapport STF36 F90098. SINTEF Bergteknikk
3-Materiais e Métodos
3.1- Microorganismos utilizados nos experimentos
3.1.1- Cepas de Saccharomycescerevisiae
As cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho estão descritas na tabela
abaixo.
Tabela 1: Cepas de Saccharomycescerevisiae utilizadas nos experimentos
∗
Nome Genótipo
aW303 Mat a ade2-1 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 can1-100 GAL mal SUC2
bYSH850
Mat a pkc∆::HIS3 (W303-1A)
cLBFM335
Mat a pkc∆::HIS3 (W303-1A) lbfm335
cLBFM 342 Mat a pkc
∆::HIS3 (W303-1A) lbfm335 MSN5
cLBFM 345 Mat a pkc
∆::HIS3 (W303-1A) lbfm335 HOS2
∗ Letras a-f, procedência das cepas de S.cerevisiae ítem 3.1.2
3.1.2- Procedência das cepas de Saccharomycescerevisiae :
a- Johan Thevelein, Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie, Katholieke
Universiteit Leuveun, Belgium.
b- Stefan Hohmann, CMB/Microbiology, Göteborg Univerty, Sweden.
c- Cepas obtidas durante o desenvolvimento da dissertação, Universidade Federal de
Ouro Preto, Brasil.
3.1.3-Cepa de bactéria
A cepa de Escherichia coli utilizada para a amplificação do DNA plasmidial foi a
TOP10F’: F’, mcr A, ∆ (mrr-hadRMS – mcrBC) Ø 80∆lacZ ∆M15, ∆lacx74, deoR, rec∆1,
3.2-Meios de cultura e condições de crescimento 3.2.1-Meios de cultura
3.2.1.1-Meio LB (Luria – Bertaine)
O meio LB é composto por triptona 1% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v) e cloreto de sódio 0,5% (p/v), pH 7,5 ajustado com NaOH. Ao meio sólido acrescenta-se ágar 1,5% (p/v).
3.2.1.2-Meio LB-XIA
O meio LB-XIA é o meio LB sólido suplementado com 20 µg/ml de X-GAL (5-
Bromo-4-Cloro-3-indolyl-β-D-galactosidase), 1 mM de IPTG (Isopropyl-β-D-
Thiogalactopyranoside) e 100 µg/ml de ampicilina.
3.2.1.3-Meio YP
O meio YP é composto por extrato de levedura 1% (pv), bacto-peptona 2% (p/v). O meio sólido é acrescido de ágar 1,5% (p/v). Para os mutantes osmossensíveis adiciona-se sorbitol 1 M final ao meio de crescimento. As fontes de carbono utilizadas foram as seguintes: glicose 2% ou 4%, glicerol 3%, rafinose 2% e frutose 2%. As fontes de carbono foram autoclavadas separadamente e acrescentadas ao meio no fluxo laminar.
3.2.1.4-Meio mínimo SD
O meio SD é composto por 6.7 g/l de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, suplementado com os aminoácidos arginina 20 mg/l, ácido glutâmico 100 mg/l, ácido aspártico 100 mg/l, fenilanina 50 mg/l, histidina 100 mg/l, isoleucina 30 mg/l, lisina 30 mg/l, leucina 250 mg/l, metionina 20 mg/l, serina 375 mg/l, triptofano 100 mg/l, tirosina 30 mg/l, treonina 200 mg/l, valina 150 mg/l e as bases adenina 50 mg/l e uracil 50 mg/l. O meio
sólido foi acrescido de ágar 1,5% (p/v). Para os mutantes osmossensíveis adiciona-se sorbitol 1M final ao meio de crescimento. O pH do meio SD foi acertado com KOH para o valor 6,5. As fontes de carbono usadas foram: glicose 2% (p/v) ou glicerol 3% (p/v).
3.2.2-Condições de crescimento
As células de Saccharomycescerevisiae foram crescidas a 30°C sob agitação de 200
rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25) em meio YP suplementado com a fonte de carbono adequada e acrescido de sorbitol 1 M para os mutantes osmossensíveis. Para as cepas transformadas portadoras de plasmídeos foi usado o meio seletivo SD, menos o aminoácido especificado como marcador.
As células de E. coli foram crescidas a 37°C sob agitação de 200 rpm (Incubabor
Rotatório New Brunswick Model G24) em meio LB.
3.3-Mutagênese da cepa YSH 850 usando radiação UV
A cepa YSH 850 foi cultivada em 5 ml de meio YPD 2% com sorbitol 1M, a 30°C
sob agitação de 200 rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25), por 24 horas. Atingida a DO600nm igual a 10, uma alíquota de 1 ml foi tranferida para um tubo de polietileno cônico, estéril, com capacidade para 15ml (FALCON) e centrifugada a 1000 g,
4°C, por 5 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as células foram
ressuspensas em 4ml de sorbitol 1M. Alíquotas de 100µl de uma diluição 1/10 desta
suspensão foram semeadas em placas de Petri contendo SD glicose 2% e SD glicerol 3%. As placas assim inoculadas foram expostas a diferentes doses (mJ) de UV (GS GENE
Dosagens em mJ de radiação UV a que as diferentes placas foram expostas para mutagênese Placas Dosagem 0 0 2 5 10 Meio de cultura SD glicose 2% SD glicerol 3% SD glicerol 3% SD glicerol 3% SD glicerol 3% SD glicerol 3% 15
Após a exposição, e ainda em ambiente escuro, as placas foram envolvidas em papel
alumínio para evitar a foto-reativação. As placas foram incubadas a 30°C, por 72 horas. Os
mutantes obtidos foram submetidos a testes seletivos específicos.
3.4-Determinação da atividade enzimática da Invertase 3.4.1- Inóculo e crescimento das células
As células de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas em 5 mL dos meios YP
glicose 4%, YP frutose 4% e YP rafinose 2%, acrescidos de sorbitol 1M para os mutantes
osmossensíveis, durante 24 horas, a 30°C, sob agitação a 200 rpm em Incubabor Rotatório
New Brunswick Model G25.
3.4.2-Preparo de extratos celulares para a determinação da atividade enzimática da invertase
Após atingir a DO600nm de uma unidade (Salgado et al, 2002), a cultura foi
celular lavado três vezes com 3 ml de tampão imidazol 200 mM com sorbitol 1 M (imidazol 200 mM, MgCl2 40 mM, KCl 400 mM, sorbitol 1 M, pH 7,0). Após este procedimento, adicionou-se, em cada tubo, 0,5 g de pérolas de vidro (0,5 mm de diâmetro)
e 500 µl de tampão imidazol 50 mM (imidazol 50 mM, MgCl2 40 mM, KCl 400 mM, pH
7,0). As células foram lisadas por agitação em vórtex (três vezes, 60 segundos) com repouso em gelo nos intervalos de agitação. Posteriormente, adicionou-se 1ml de tampão
imidazol 50 mM e 2,5 µl de uma solução de PMSF 100 mM (Phenylmetyl Sulphonyl
Fluoride). A mistura foi transferida para um tubo de microcentrifuga tipo eppendorf 1,8 ml e centrifugada a 3500 rpm (Heraeus Sepatech, Biofure 13), durante 5 minutos. O sobrenadante foi coletado e acondicionado em tubos de amostra do aparelho COBAS. O
extrato livre de células foi estocado em temperatura de -20°C até o momento da dosagem
(Salgado et al., 2002).
3.4.3-Dosagem da invertase
A dosagem da enzima invertase foi realizada no aparelho de dosagem bioquímica
COBAS-FARA (Roche), tendo sido utilizado como substrato para a reação uma solução de
sacarose 0,3 M em acetato de potássio 100 mM pH 5,1. Após 5 minutos de incubação, a
30°C, a reação foi interrompida pela adição de NaOH 1 M. Em seguida um volume igual de
HCl 1M foi adicionado para neutralizar o pH da reação. A glicose liberada foi determinada pela reação clássica de glicose-oxidase/peroxidase, tendo a ortodianisidina como reativo de cor. A leitura da absorbância foi feita a 560 nm. A atividade da enzima invertase foi expressa em nmoles de glicose/min/mg proteína.
3.4.4- Dosagem de proteína
3.5-Curva de crescimento 3.5.1-Preparo do inóculo
As leveduras foram inoculadas em 5 ml de meio YPD 2% com sorbitol 1 M e
incubadas por 24 horas, a 30°C, sob agitação a 200 rpm em Incubabor Rotatório New
Brunswick Model G25. Após esse período mediu-se a densidade óptica das células a 600nm (DU-68 Spectrophotometer-Beckman). Calculou-se o volume necessário do pré-inóculo para que a densidade óptica atingisse um valor final entre 0,1 a 0,2 em um erlenmeyer contendo 25 ml de meio de cultura. Assim, este volume foi usado no inóculo de 150 ml dos meios YPD 2% ou YPD 2% adicionado de 2 ppm de antimicina. Incubou-se esse inóculo a
30°C, por 24 horas, sob agitação de 200 rpm em Incubabor Rotatório New Brunswick
Model G25.
3.5.2-Construção da curva de crescimento
A cada 3 horas, por um período de até 72 horas, coletou-se alíquotas de 1 mL das amostras em estudo para efetuar a medida da DO600nm em espectrofotômetro Beckman modelo DU-68. As leituras da densidade óptica foram usadas na construção da curva representando o perfil de crescimento das células.
3.6-Teste de crescimento em diferentes meios de cultura
As cepas de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas em tubos de ensaio
contendo 5 ml de meio YP glicose 2%, acrescido de sorbitol 1 M para os mutantes
osmossensíveis, durante 24 horas, a 30°C, sob agitação de 200 rpm em Incubabor Rotatório
New Brunswick Model G25. Após este período, mediu-se a densidade ótica das culturas a 600 nm (DU-68 Spectrophotometer-Beckman). A partir dos valores obtidos calculou-se o volume de inóculo em que todas as cepas possuíam a mesma leitura de densidade óptica 1. A quantidade estipulada de células foi centrifugada a 1000g, por 4 minutos e lavada com
sorbitol 1M. As células foram suspensas em 5 µl de meio YP glicose 2%. Utilizaram-se 5
µl da suspensão de células para inocular cada meio de cultura sólido. As placas foram
incubadas a 30°C, durante 72 a 96 horas.
3.7-Determinação da localização intracelular da proteína Mig1 através da microscopia de fluorescência
Após o crescimento das cepas W303, pkc1
∆
e LBFM335 (transformadas complasmídio contendo domínio de transporte do gene MIG1 com fusão ao gene GFP) em 5 ml
de meio YP glicose 2% suplementado com sorbitol 1M até DO600nm 1, a suspensão celular foi centrifugada a 1000g por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e as células foram lavadas duas vezes com sorbitol 1M. Após este procedimento, as células foram ressuspensas
em 5 ml de meio YP glicose 2% com sorbitol 1M e mantidas a 30°C, sob agitação de 200
rpm em Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25. Percorrido 1 hora de incubação,
100 µl da cultura foram lavados duas vezes em glicose 2% com sorbitol 1 M. Destas células
resultaram as imagens das células em condição de repressão. O restante do volume da cultura foi lavado duas vezes em rafinose 2% com sorbitol 1 M, o sobrenadante foi decartado e as células foram ressuspensas em 5 ml de meio YP rafinose 2% com sorbitol 1 M e 1 hora após a incubaçaõ realizou-se a observação da fluorescência.
As lâminas foram preparadas através da mistura de 7 µl da cultura com 7µl de
agarose 1% e as análises microscópicas foram realizadas no microscópio de fluorescência (marca Olympus BX 51 TRF). Para corar o DNA foi usada uma solução de Hoechst 33342 a 2% (fabricante Molecular Probes)
3.8-Transformação de levedura com biblioteca genômica 3.8.1-Purificação do DNA plasmidal da biblioteca genômica
Duas diferentes bibliotecas genômicas de Saccharomyces cerevisiae (YEP13 muti-
copy vector, ATCC 37329 e YRP7 single-copy vector, ATCC37324) foram amplificadas
em células de Escherichia coli. As bibliotecas foram inoculadas em 100 ml de meio LB
contendo 100µg/ml de ampicilina. Esse inóculo foi incubado por 10 a 12 horas, 37°C, sob
agitação de 200 rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G24). Após este período, o DNA plasmidial foi purificado usando o Kit de purificação plasmidial Nucleobond AX. O DNA plasmidial foi analisado por eletroforese em gel de agarose e visualizado por coloração com brometo de etídio através de um trans-iluminador. Com a medida da densidade ótica em 260nm estimou-se a quantidade do DNA plasmidial e pela relação DO260nm/DO280nm verificou-se a pureza do mesmo.
3.8.2- Dosagem de DNA
A quantificação do DNA foi realizada através da leitura no espectrofotômetro (Du- 68 Spectrphotometer-Beckman) a 260 e 280nm.O fator de conversão DO 1 corresponde à
concentração de DNA de 50 µg/ml de acordo com o protocolo descrito por Sambrook et al.,
(1989). As razões entre as leituras Abs260nm/Abs280nm foram estimadas para verificar a pureza do DNA. A amostra foi considerada pura quando os valores estavam entre 1,8 e 2,0.
3.8.3-Tranformação de levedura
3.8.3.1-Preparo de células de levedura competentes
A cepa de Sacharomyces cerevisiae a ser transformada foi crescida a 30°C, 200
rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25), durante 24 horas, em 5 ml de YP glicose. Este pré-inóculo foi utilizado para inocular 100 ml do mesmo meio e foi incubado nas mesmas condições de temperatura e agitação descritas acima, até que a cultura atingisse
um valor de densidade ótica de 0,6. Após o crescimento, as células foram coletadas por centrifugação a 1.000g por 4 minutos. O sobrenadante da cultura foi descartado e as células foram lavadas com 20 ml de TE (10mM de Tris-HCl pH 8,0, 1mM EDTA) e suspensas em
5 ml de TE acrescidos de 250 µL de uma solução de LiAc 2,5 M. A suspensão de células
foi incubada a 30°C sob agitação de 200 rpm durante no mínimo 1 hora. As células de
levedura, tornadas competentes pelo tratamento descrito acima, foram aliquotadas em
frações de 300µl e usadas imediatamente.
3.8.3.2-Transformação de leveduras
Em um tubo de microcentrífuga contendo 300 µl de leveduras competentes,
adicionaram-se 5 µg do DNA plasmidial de interesse e 10 µl de DNA de esperma de
salmão (10mg/ml), previamente desnaturado a 95°C (Thermomixer 5436). Após incubação
por 30 minutos a 30°C, foram adicionados 700µL de PEG 4000 (50%), procedeu-se a
homogeneização do conteúdo delicadamente e incubou-se novamente por 1 hora nas mesmas condições anteriores. Em seguida, as células foram submetidas a choque térmico a
42°C, por 10 minutos, e logo após, foram centrifugadas por 1 minuto a 4.000 rpm (Heraeus
Sepatech, Biofure 13). Após essa nova centrifugação nas mesmas condições anteriores, o sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas no sobrenadante residual e plaqueadas com pérolas de vidro em meio sólido seletivo (SD-marcador). As placas foram
incubadas a 30°C, por 48 a 72 horas. As colônias crescidas nos meios seletivos foram
inoculadas em meio líquido YP glicose 2% para posterior confirmação dos marcadores genéticos com o objetivo de confirmar se a transformação foi efetiva (Ito et al., 1983).
Como controle negativo do experimento, utilizamos 300 µl de leveduras competente
3.9-Preparação do DNA plasmidial de levedura
As células foram inoculadas em 5 ml de meio YPD 2% e incubadas até a fase
estacionária, a 28°C, sob agitação de 200 rpm em incubador New Brunswick Model G25. O
volume total da cultura foi centifugado por 3 minutos, 4°C, 1000 g. O sobrenadante foi
descartado e as células suspensas em 400 µl de solução Lyticase 1000 U/ml (0.3 mg/ml
Lyticase e 8 µl/ml β-Mercaptaetanol em tampão de extração) e incubadas a 37°C por 2-3
horas. Após este procedimento, adicionaram-se 400 µl de tampão de lise (SDS 2% em Tris-
HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8), agitou-se cuidadosamente incubando-se posteriormente
por 10 minutos à temperatura ambiente. A seguir, adicionaram-se 200 µl de NaCl 5 M
matendo-se a suspensão em gelo por 2 horas. Em seguida, procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). O sobrenadante foi transferido
para um novo tubo e o “pelet” foi descartado. Ao sobrenadante adicionaram-se 400 µl de
PCI (fenol/clorofórmio/álcool isoamílico na proporção 25:24:1) promovendo-se a homogeneização em vórtex por 2 minutos. A seguir, o tubo foi centrifugado por 12 minutos a 13000rpm (Heraeus Sepatech, Biofure 13). Ao término da centrifugação, a camada superior foi transferida para outro tubo eppendorf e a este foram adicionados 2 volumes de
etanol PA. Este tubo foi mantido à temperatura de -20°C por no mínimo 1 hora. Após este
período, procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 3500 rpm (Heraeus Sepatech,
Biofuge 13). O sobrenadante foi descartado, o sedimento lavado com 500 µl de etanol 70%
e novamente centrifugado nas mesmas condições anteriores. Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante e secando-se o sedimento a vácuo (‘Speedvac”Savante AS
290). O DNA foi ressuspenso em 20 µl de água deionizada (Sistema Milli-Q Millipore).
3.10-Preparação de células de bactérias competente
A bactéria Escherichia coli Top 10 F’, estocada à - 70°C com 25% glicerol, foi
estreptomicina a 37°C durante 16 horas. Uma colônia dessa cultura foi inoculada em 3 ml de meio LB e incubada sob agitação de 200 rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G24) nas mesmas condições descritas acima. Após este período, utilizou-se uma
alíquota de 1 ml dessa cultura para inocular 100 ml de meio LB, mantidos a 37 °C sob
agitação de 200 rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G24) até atingir a DO600nm próxima de 0.8 nm (Du-68 Spectrophtometer-Beckman). Após o crescimento, as
bactérias foram coletadas por centrifugação a 1.000g, por 10 minutos, a 4°C. O sedimento
celular foi suspenso em 40 ml de CaCl2 0.1 M e mantido em gelo por 1 hora. Após centrifugação, as células foram suspensas em 1 ml de CaCl2 1M. As células competentes
foram aliquotadas e usadas imediatamente ou estocadas a -70°C em presença de glicerol em
uma concentração final de 25%.
3.11-Transformação de bactérias
Cerca de 10 ng de mistura de ligação ou 2 µl de plasmídio foram adicionados a um
tubo eppendorf de 1,8 ml contendo 100 µl de bactéria TOP 10F’competentes (ítem 3.9).
Este material foi mantido em gelo por 30 minutos. Após este período, as células foram
submetidas a um choque térmico a 42°C por 2 minutos. Em seguida, as células foram
mantidas em 1 ml de meio LB, a 37°C, por 50 minutos. Após centrifugação a 6.000 rpm
(Heraeus Sepatech, Biofure 13) por 1 minuto o sobrenadante foi descartado. As células
foram suspensas em 100 µl de LB, plaqueadas com auxílio de pérolas de vidro em meio
LB-XIA e incubadas a 37°C por 16 horas. As colônias selecionadas foram inoculadas em 3
ml de meio líquido LB-ampicilina (100 µg/ml) e crescidas a 37°C sob agitação 200 rpm
3.12-Mini preparação de DNA plasmidial de bactéria
As colônias brancas obtidas no procedimento anterior foram inoculadas em 5 ml de
meio LB-ampicilina100 µg/ml a 37° C por 12 horas. Após o crescimento, a suspensão de
células foi transferida para tubos de microcentrífuga de 1,8 ml e centrifugada a 3500 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento celular ressuspenso em 200 µl de STET (sacarose 8%, TritonX 0,1%, EDTA 50
mM e Tris-HCl 50mM, pH 8), foi acrescido de 5 µl de lisozima (50 mg/ml), sendo
incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. Após este período, o material foi aquecido
a 95°C por 45 segundos e em seguida centrifugado a 13000 rpm (Heraeus Sepatech,
Biofuge 13) por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de
microcentrífuga de 1,8 ml, adicionado de 8 µl de CTAB (Brometo de trimetil amônio 5%) e
centrifugado a 13000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em
300 µl de NaCl 1,2M, sendo homogeneizado em vórtex. Após este procedimento,
adicionaram-se 750 µl de etanol 100% e o material foi incubado a -20°C, por no mínimo 1
hora. Percorrido este tempo, procedeu-se a centrifugação a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o DNA plasmidial foi lavado
com 800µl de etanol 70%. Após uma nova centrifugação nas mesmas condições, o
sobrenadante foi eliminado e o DNA seco a vácuo (‘speedvac’Savant AS 290). O DNA
plamidial foi ressuspenso em 20 µl de água milli-Q (Sistema Milli-Q Millipore).
3.13-Reações de digestão utilizando enzimas de restrição
O DNA genômico de Sacharomyces cerevisiae ou os plasmídios foram digeridos
com as endonucleases de restrição adequadas nos tampões recomendados pelo fabricante.
Nas reações foram utilizadas cerca de 2 unidades de enzima para cada µg de DNA e a
mistura de reação foi incubada por 2 horas a 37°C. O volume final da reação variou
3.14-Eletroforese em gel de agarose
As eletroforeses dos fragmentos de DNA foram conduzidas em gel de agarose 1% (p/v) em tampão TAE (0,04 M TRIS, 1 mM EDTA, pH 8,0 ajustado com Ácido acético).
Antes da aplicação das amostras adicionou-se às mesmas 1 µl de loading buffer (6X-azul
de bromofenol 0,25%, xilenocianol 0,25%, sacarose 40% p/v).
As corridas foram conduzidas a 50 ou a 100 V usando-se a fonte LKB-GPS200/400 (Pharmacia). Após a corrida eletroforética os géis foram corados por brometo de etídio
(solução estoque 0.5 µg/ml), sob agitação por 10 a 30 minutos. Os géis foram visualizados
no transiluminador a 365 nm e fotografados por um sistema Sony (KAISER-RSI).
3.15-Ligação de fragmentos de DNA a plasmídios
As ligações foram feitas utilizando aproximadamente 10 ng de vetor e 100 ng de
fragmento em tampão de ligase 1X e 5 U de T4 DNA ligase em um volume final de 20 µl.
As reações foram incubadas a 16°C por 12 horas.
3.16-Sequenciamento
As reações de sequenciamento foram feitas de acordo com o método descrito por SANGER e cols. (1997), utilizando-se o Kit de sequenciamento DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for Mega BACE DNA Analysis System (Amersham Biosciences).
3.17-Preparação do DNA genômico de levedura
As células de Sacharomyces cerevisiae foram crescidas em tubos de ensaio
contendo 5 ml de YPD 2% com sorbitol 1 M até a fase estacionária, a 28° C, sob agitação
foi transferido para tubos eppendorf e centrifugado por 5 minutos, a 4 °C, 1000 g. O sobrenadante foi descartado e as células foram suspensas em 0,5 ml de água destilada e centrifugadas por 3700 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 3 minutos. O sobrenadante
foi decartado e as células foram ressuspensas em 200 µl de tampão de extração (sorbitol 1
M, citrato de sódio 100 mM, EDTA 60 mM, pH 7). A seguir, adicionaram-se 100 µl de
solução Lyticase 1000 U/ml (0.3 mg/ml Lyticase e 8 µl/ml β-Mercaptaetanol em tampão de
extração) e agitou-se ligeiramente. Esse tubo foi incubado por 3 horas a 37 °C. Após este
procedimento, adicionaram-se 300 µl de tampão de Lise (SDS 2% em Tris-HCl 50 mM,
EDTA 10 mM, pH 8), agitou-se ligeiramente e procedeu-se uma incubação por 10 minutos
à temperatura ambiente. Após a incubação, adicionaram-se 200 µl de NaCl 5 M, mantendo-
se o material em gelo por 2 horas. Ao término desse tempo, procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). O sobrenadante foi
descartado e o sedimento ressuspenso em 300 µl de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM,
pH 8).
Em seguida, adicionou-se ao tubo 400 µl de PCI (fenol/clorofórmio/álcool
isoamílico na proporção 25:24:1) promovendo-se uma homogeneização em vórtex por 2 minutos. Após este procedimento, o tubo foi centrifugado por 10 minutos a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). Ao término da centrifugação, a camada superior foi transferida para outro tubo eppendorf de 1,8 ml e a este foram adicionados dois volumes de
etanol 100%. Este tubo foi mantido à temperatura de -20°C por no mínimo 1 hora. Após
este período, procedeu-se uma centrifugação por 10 minutos a 3500 rpm (Heraeus
Sepatech, Biofuge 13). O sobrenadante foi descartado, o sedimento lavado com 500 µl de
etanol 70% e novamente centrifugado nas mesmas condições. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento secado a vácuo (‘Speedvac’ Savant AS 290). O
3.18-Clonagem do gene MSN 5 no vetor pBluescript II SK (+/-)
3.18.1-PCR do gene MSN 5
Com o objetivo de verificar possíveis mutações no gene MSN 5 do mutante LBFM
335, realizou-se uma reação de PCR (reação de polimerase em cadeia) utilizando como molde o DNA genômico desta cepa.
A reação de amplificação foi preparada como descrito abaixo:
3 µl de dNTP (0,25mM)
1µl de iniciador direto (20 pmol/µl)
1µl de iniciador reverso (20 pmol/µl)
3µ de tampão da TAQ Polimerase (1X)
2 µl de DNA genômico (0,3 µg)
0.5 µl de taq polimerase
19,5 µl de água deionizada
Obs: o tampão da taq polimerase utilizado continha cloreto de magnésio (15 mM).
As reações foram conduzidas em um termociclador (Mastercycler, Eppendorf),de