januar 2003. Institutt for bygg, anlegg og transport

Embora a Pkc1 p tenha sido descrita inicialmente como uma proteína reguladora de uma via de MAP quinases, vários trabalhos têm demonstrado o seu envolvimento direto em alguns eventos de sinalização tais como a repressão da síntese de ribossomos e células deficientes na secreção de rRNA (Nanduri et al., 1999), a relocação transietória de muitas proteínas do citoplasma durante condições de choque hipertônico (Nanduri & Tartakoff, 2001) ou a máxima atividade da N-glicosilação (Park & Lennarz, 2000). Em todos estes casos não há participação dos demais componentes da via PKC MAP quinase (Perez & Calonge, 2002). Assim, estes resultados, juntamente com fato de que o fenótipo do mutante pkc1

∆

é mais severo do que os dos mutantes com deleção nos demais componentes da via PKC MAP quinase, evidenciam que a Pkc1 p está envolvida em outras funções importantes em leveduras.

De fato, nosso grupo de trabalho tem estudado o envolvimento de Pkc1 p no controle de diferentes efeitos induzidos por glicose. Brandão et al., (2002) demonstraram

que, no contexto da repressão por glicose, o mutante pkc1

∆

, quando comparado com a

cepa selvagem, apresenta baixa capacidade respiratória; baixo ou lento crescimento em glicerol, galactose ou rafinose. Este mutante ainda apresenta um defeito na desrepressão da

atividade invertásica em conseqüência de uma alteração na expressão do gene SUC2, após a

transferência das células de meio contendo glicose para meio contendo rafinose. Além disso, Salgado et al., (2002) encontraram evidências de que Pkc1 p provavelmente atua na via principal de repressão por glicose controlando a localização do fator transcricional Mig1.

Deste modo, com o intuito de isolar novos componentes envolvidos na via de desrepressão de genes mediada pela proteína quinase C, foi desenvolvida uma estratégia

para a obtenção de um novo mutante (mutagênese da cepa pkc1

∆

) que apresentasse como

fenótipo global a reversão daquelas características observadas no mutante pkc1

∆

. Desta

crescimento; segunda fase de crescimento normal e também caracterizada pela metabolização do etanol produzido na primeira fase; e ainda, capacidade de crescimento em outras fontes de carbono não fermentáveis.

A levedura Saccharomyces cerevisiae é capaz de utilizar o glicerol como a única

fonte de carbono e energia. O glicerol pode permear a membrana plasmática por difusão passiva (Gancedo et al., 1968), difusão facilitada através do canal protéico Fps1 p (Luyten et al., 1995) e pelo sistema simporte glicerol/próton (Lages & Lucas, 1997). A degradação do glicerol ocorre através de uma via fosforilativa (Sprague & Lucas, 1977). No primeiro passo da via, o glicerol é convertido em glicerol-3-fosfato pela enzima glicerol quinase,

codificada pelo gene GUT1. Então o glicerol-3-fosfato é oxidado a dihidroxiacetona fosfato

pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial, codificada pelo gene GUT2. A

dihidroxiacetona fosfato é catabolizada na glicólise ou é usada para a síntese da glicose-6-

fosfato durante a gliconeogênese. Mutantes nulos tanto para GUT1 e GUT2 são incapazes

de crescer em glicerol como única fonte de carbono (Sprague & Cronan, 1977) sugerindo que esta via seja a única rota para o catabolismo de glicerol. Assim, como os mutantes

gut1

∆

e gut2

∆

, o mutante pkc1

∆

é incapaz de crescer em glicerol, sugerindo um importante

papel da Pkc1 p no catabolismo desta fonte de carbono em leveduras. De fato, a Pkc1 p parece ser responsável pela fosforilação da proteína Opi1 (Sreenivas et al., 2001) que é um

regulador negativo da expressão do gene GUT1 (Grauslund et al., 1999). Sreenivas et al.,

(2001) demonstraram que a fosforilação de Opi1 p pela Pkc1 p atenua a função regulatória

negativa de Opi1 p na expressão do gene INO1, envolvido na síntese de fosfolipídios em

leveduras. Ainda não está claro como a fosforilação de Opi1 p pode afetar sua função, contudo, como dados da literatura demonstram a importância de Pkc1 p na relocação de fatores transcricionais (Naduri & Tartakoff, 2001, Salgado et al., 2002), é possível que a fosforilação de Opi1 p por Pkc1 p seja importante no controle da sua localização celular.

Desta forma, é provável que em cepas pkc1

∆

o gene GUT1 se encontre constitutivamente

reprimido por Opi1, impedindo desta forma que esta cepa cresça em glicerol. Assim, como a cepa LBFM335 recuperou a capacidade de crescer em glicerol, é razoável supor que esta

cepa apresente uma mutação em um gene que esteja envolvido na via de desrepressão na qual o produto gênico Pkc1 teria uma participação.

Além da capacidade de crescimento em glicerol, o mutante LBFM335 ainda reverte

um dos fenótipos mais marcantes apresentados pela cepa pkc1

∆

, ele possui uma atividade

invertásica constitutivamente desreprimida independente da fonte de carbono. Como citado

anteriormente, o gene SUC2 codifica a enzima invertase responsável pela hidrólise da

sacarose em glicose e frutose. Este gene é um modelo conveniente para a avaliação dos estados de repressão e desrepressão celular, já que ele é unicamente regulado pelo mecanismo de repressão por glicose e não é induzido pelos substratos sacarose ou rafinose. Mais uma vez, este fenótipo sugere que a proteína mutada na cepa LBFM335 esteja envolvida na desrepressão de genes após a exaustão da glicose como a proteína quinase C, e mais, a mutação desta proteína a torna independente da regulação de Pkc1 p.

Além disso, a diauxia observada no crescimento em glicose do mutante LBFM335, semelhante ao observado na respectiva cepa selvagem, indica uma desrepressão normal dos sistemas envolvidos na fase respiratória, o que é confirmado pelo fato de que na presença de antimicina há uma inibição do crescimento logo após a fase fermentativa. Em conjunto,

estes dados sugerem que, ao contrário da cepa pkc1

∆

que não apresenta crescimento

respiratório mesmo na ausência de antimicina, a cepa LBFM 335 é capaz de desreprimir os genes envolvidos na utilização de fontes de carbono não fermentáveis.

Esta observação foi confirmada também a partir de um teste de crescimento do mutante LBFM335 em diferentes fontes de carbono. Como esperado, LBFM335, como a

cepa pkc1

∆

, não cresce na ausência de sorbitol, demonstrando que a mutação não suprimiu

a ausência de Pkc1 na via de sinalização PKC MAPquinase. Este teste também confirmou os resultados anteriores, ou seja, a recuperação da capacidade respiratória de LBFM335, já que esta, como a cepa selvagem, foi capaz de crescer em fontes de carbono não fermentáveis.

Uma outra informação interessante a respeito do mutante LBFM335 é que este,

apesar de reverter os principais fenótipos repressivos da cepa pkc1

∆

, apresenta Mig1

condições repressivas ou desrepressivas. Estes resultados sugerem que talvez Pkc1 não esteja envolvida unicamente na translocação nuclear do fator Mig1.

Estes resultados sugerem que a mutação ocorrida na cepa LBFM335 possivelmente tenha ocorrido em um gene que codifica para uma proteína envolvida na desrepressão de genes que normalmente ocorre após a exaustão da glicose. Além disto, pode-se imaginar que esta proteína apresente agora como característica uma atividade cuja regulação tenha se tornado independente da presença de uma Pkc1 p funcional.

Embora não seja possível descartar a hipótese que a mutação na cepa LBFM 335

tenha ocorrido nos genes MIG1 ou HXK2, é provável que este não seja o caso, pois apesar

das proteínas Mig1 e Hxk2 estarem diretamente envolvidas na repressão do gene SUC2

(Herrero et al., 1998), Mig1 p não parece ter uma importância significativa no controle do metabolismo do glicerol (Grauslund et al., 1999) e dos genes respiratórios (Schüller, 2003) e não há dados concretos na literatura a respeito do envolvimento direto da Hxk2 na repressão destes genes. Desta forma, provavelmente a mutação ocorreu em um gene que codifica para uma proteína que está envolvida tanto na desrepressão do gene SUC2 como na desrepressão dos genes envolvidos no metabolismo do glicerol e na respiração.

Considerando então a possibilidade que a irradiação UV tenha induzido uma mutação no gene que codifica para uma proteína sob o controle da Pkc1 p, a cepa LBFM335 foi transformada com bibliotecas genômicas de levedura. Esta estratégia tem como objetivo tentar isolar transformantes que apresentem redução no nível de atividade desta proteína mutada com a introdução de cópias normais da mesma. Usando a incapacidade de crescer em glicerol como critério para a seleção dos transformantes e ainda observando outros fenótipos, nós obtivemos dois transformantes que recuperaram, pelo menos parcialmente no caso da atividade invertásica, os fenótipos apresentados pela cepa pkc1

∆

, ou seja, estes transformantes são incapazes de crescer em glicerol; apresentam segunda fase de crescimento em glicose respiratória; e ainda, incapacidade de crescimento em outras fontes de carbono não fermentáveis.

Os DNAs plasmidiais dessas cepas foram isolados e subclonados em plasmídio próprio para sequenciamento. O sequenciamento e a análise comparativa dos dados

permitiram identificar a proteína Msn5 (transformante 342) e a histona deacetilase Hos2 (transformante 345) como sendo os responsáveis pela supressão do fenótipo apresentado pela cepa LBFM335.

Para verificar se MSN5 e HOS2 foram os genes mutados na cepa LBFM335, ou se

estes são supressores extragênicos desta mutação, estes genes foram amplificados a partir do DNA genômico do mutante LBFM 335; subseqüentemente clonados em plasmídios adequados para o sequenciamento; tendo sido possível verificar que estes genes não se encontram mutados na cepa LBFM335. Desta forma, foi demonstrado que, embora a

superexpressão de MSN5 e HOS2 suprima os fenótipos estudados, MSN5 e HOS2 não são

os genes afetados no mutante.

A proteína Msn5, isolada como um supressor dos fenótipos apresentados pelo

mutante LBFM335, é um membro da família de exportina β envolvida na translocação do

repressor transcricional Mig1 do núcleo para o citoplasma. Aparentemente, Mig1 p contém um sinal de exportação nuclear que é fosforilado por Snf1 p provocando seu reconhecimento por Msn5 p (DeVit & Johnston, 1999). Estes achados explicam porque Msn5 p foi originalmente isolada como um supressor multi-cópia de mutações de Snf1 p (Estruch & Carlson, 1990 e 1993). Um nível aumentado de Msn5 permite a exportação do repressor Mig1, mesmo na ausência de fosforilação, suprimindo a perda da quinase Snf1 (Schüller, 2003). Brandão et al., (2002) suspeitaram que a Pkc1 p poderia estar envolvida na via principal de repressão por glicose ativando Snf1 p, contudo outros resultados confirmaram que este não é o caso, já a Snf1 é de fato fosforilada pelas quinases Pak1 p, Tos3 p e Elm1 p (Nath et al., 2003; Hong et al., 2003). Salgado et al., (2002) ainda encontraram evidências que Pkc1 p atua na via principal de repressão controlando a localização celular do fator transcricional Mig1. Este trabalho também sugeriu que o controle da localização celular de Mig1 pode se dar pela atuação de Pkc1 p na regulação do fator de translocação necessário para a exportação de Mig1 do núcleo para o citoplasma, no caso a exportina Msn5.

Por sua vez, o produto gênico HOS2 está envolvido na regulação da transcrição de

cromatina na regulação transcricional tem se tornado mais clara com a descoberta das atividades de remodelamento do nucleossomo dependente de ATP (como Swi/Snf1), histonas acetiltransferase (HATs) e histonas deacetilases (HDACs) (Kingston e Narlikar, 1999). As histona deacetilases da classe I responsável pela deacetilação dos resíduos de lisina da cauda das histonas H3 e H4 (Wang et al., 2002). O complexo co-repressor Ssn6- Tup1, envolvido na regulação de um grande conjunto de genes, entre os quais os genes reprimidos por glicose (Smith & Johnson, 2000), interage diretamente com as histonas influenciando a organização da cromatina. Tup1, mais especificamente, interage preferencialmente com as isoformas H3 e H4 deacetiladas e requer múltiplas histonas deacetilases para sua função repressiva (Davie et al., 2003). Tanto que a hiperacetilação de histonas causada pela mutação combinada dos genes que codificam para as histonas deacetilases Rpd3, Hos1 e Hos2 abole a repressão por Ssn6-Tup1 (Watson et al., 2000).

Embora as histonas deacetilases da classe I terem sido descritas de forma associada

à repressão de genes em Saccharomyces cerevisiae, Wang et al., (2002) demonstraram que

a histona deacetilase Hos2, um membro da classe I, é diretamente necessária para a

ativação de genes, tais como GAL e INO1. Desta forma, ressaltando a complexidade deste

processo, Rpd3 e Hos2, ambas histonas deacetilases da classe I, exercem efeitos opostos na transcrição. Diferenças na dinâmica da ligação entre Rpd3 e Hos2, bem como a deacetilação adicional das histonas H2A e H2B por Rpd3 podem ser responsáveis pelos seus papéis diferentes na regulação dos genes.

Apesar dos supressores extragênicos Msn5 e Hos2 estarem envolvidos na via repressão por glicose, os resultados apresentados neste trabalho não são suficientes para estabelecer uma relação conclusiva entre a proteína quinase C e os genes Msn5 e Hos2 no contexto da desrepressão de sistemas enzimáticos após a exaustão da glicose. Contudo, estes resultados permitem a criação de um modelo especulativo sobre o envolvimento da

Pkc1 p na desrepressão de genes na levedura Saccharomyces cerevisiae em que há o

envolvimento das proteínas Msn5 e Hos2.

Neste modelo, na presença de glicose (independente de sua concentração) a Pkc1 p poderia ativaria um fator desconhecido que seria necessário para a preparação e/ou indução

do processo de desrepressão gênica, após o esgotamento de glicose no meio. Por este processo, haveria uma ativação/alocação de fatores nucleares essenciais ao processo de

desrepressão. Desta forma, em uma cepa pkc1

∆

estes fatores jamais seriam

apropriadamente ativados/alocados fazendo com que as células permaneçam em estado de repressão, independentemente das condições de crescimento. Por este modelo, poderíamos imaginar que na cepa 335 este fator controlado por Pkc1 p estaria mutado, tornando-se independente desta regulação, e por isto o mecanismo de desrepressão estaria sempre na sua forma ativa. Ainda assim, é importante observar que mesmo na cepa 335, o fator Mig1 p permanece no núcleo sugerindo um maior grau de complexidade para o processo de desrepressão gênica.

Por outro lado, quando um número maior de cópias do gene MSN5 (transformante

342) é introduzido na cepa 335 haveria uma inibição de desrepressão, pelo fato de que provavelmente outros fatores essenciais à desrepresão estariam sendo translocados do núcleo para o citoplasma. Por sua vez, a reversão parcial do fenótipo do mutante LBFM

335 pela superexpressão do gene HOS2 poderia ser explicado pelo fato de que esta enzima

deacetilassse histonas deacetilases envolvidas na repressão, como Rpd3.

Com relação a Msn5 p, é possível ainda especular que esta exportina seria a responsável pela translocação de Hos2 do núcleo para o citoplasma na ausência de glicose. A superexpressão de Msn5 levaria a uma reversão parcial do fenótipo desrepressivo da cepa LBFM335, já que nesta situação um nível aumentado de cópias Msn5 permitiria a exportação da histona deacetilase Hos2 independentemente se as células estivessem crescendo em condições repressivas ou desrepressivas.

Obviamente, este é um modelo hipotético sendo ainda necessários vários experimentos para comprovar sua eventual validade.

Figura 14- Modelo especulativo sobre o envolvimento da Pkc1 p na desrepressão de genes

na levedura Saccharomyces cerevisiae com o envolvimento das proteínas Msn5 e Hos2.

De acordo com este modelo, na presença de glicose, Pkc1 p atuaria preparando o processo de desrepressão com a ativação/relocação de proteínas, tais como Msn5 e Hos2. Uma vez ativadas, e com a concomitante redução da atividade do processo de repressão (ausência ou baixa concentração de glicose), a exportina Msn5 transporta Mig1 p para o citoplasma, enquanto que Hos2p deacetila sítios específicos levando a transcrição de alguns genes.

+

Pkc1 Fator Genes reprimidos por glicose Mig1 Tup1 Ssn6 Presença de glicose Genes reprimidos por glicose Mig1 Rpd3 Msn5 Hos2 Hos2 Msn5 Mig1 Pkc1

Ausência ou baixa concentração de glicose

+

Desrepressão (ativação/ alocação de fatores) Fator Desrepressão (ativação/ alocação de fatores) Msn5 Hos2

+

+

+

Pkc1 Fator Genes reprimidos por glicose Mig1 Tup1 Ssn6 Presença de glicose Genes reprimidos por glicose Mig1 Rpd3 Msn5 Hos2 Hos2 Msn5 Mig1 Pkc1

Ausência ou baixa concentração de glicose

+

Desrepressão (ativação/ alocação de fatores) Fator Desrepressão (ativação/ alocação de fatores) Msn5 Hos2

+

+

+

Pkc1 Fator Genes reprimidos por glicose Mig1 Tup1 Ssn6 Presença de glicose Genes reprimidos por glicose Mig1 Rpd3 Msn5 Hos2 Hos2 Msn5 Mig1 Pkc1

Ausência ou baixa concentração de glicose

+

Desrepressão (ativação/ alocação de fatores) Fator Desrepressão (ativação/ alocação de fatores) Msn5 Hos2

+

+

6- Perspectivas

Verificar a localização celular da proteína Opi1 em condições de repressão e

desrepressão em células selvagem, células pkc1

∆

e células do mutante LBFM335.

Super-expressar os genes MSN5 e HOS2 nas cepas selvagem e pkc1

∆

e

posteriormente dosar a atividade invertásica e testar o crescimento destas cepas em glicose e em outras fontes de carbono para tentar estabelecer uma relação mais concreta entre Pkc1 e Hos2p e Msn5.

Verificar a localização celular da histona deacetilase Hos2 em condições de

repressão e desrepressão em células selvagem, células pkc1

∆

e células do mutante

In document Miljøvennlige vegdekker : statusrapport på støv for Norge, Sverige og Finland (sider 86-104)