Seqüenciació de genoteques pel mètode

2.5.1.1. Construcció de genoteques a partir de fragments de DNA amplificats per long-PCR i digerits amb endonucleases (Capítol II)

Els fragments llargs del mitogenoma de M. longipes (aprox. 10 kb i 5 kb) es digeriren independentment amb tres endonucleases de restricció (DraI, RsaI i TaqI) segons les especificacions del fabricant. Les quantitats utilitzades per a la digestió foren de 20 µL de DNA purificat (aprox. 1 µg), 2.4 µL de tampó i 1,6 µL (10.5 unitats) d’enzim de restricció. Les digestions dels dos primers enzims s'incubaren tota la nit a 37 ºC i a 65 ºC per TaqI. Després, les digestions s’incubaren a 96 ºC durant 10 minuts per inactivar la reacció enzimàtica. Els fragments resultants es comprovaren en gels d’agarosa al 2% i s’observà que produïren un rang de fragments de DNA de 150 pb a 1,5 kb. La resta de les digestions de les tres endonucleases es mesclaren a un sol tub i es aquest es purificà amb el MiniElute PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Alemanya).

Tot seguit es lligaren els fragments de DNA purificat dins el vector de clonatge pJET1.2 (CloneJET™ PCR Cloning kit, Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) segons les recomanacions del fabricant. Aquest vector confereix a la cèl·lula portadora resistència per a l’antibiòtic ampicil·lina i addicionalment, conté un gel letal situat al lloc de clonatge, el qual es veu interromput en el moment que el producte de PCR s’insereix en el lloc de clonatge. La transformació de les cèl·lules competents amb CaCl2 de Escherichia coli (One-shot® TOP10 E. Coli cells, Invitrogen, Madison, WI, USA) es va fer mitjançant la tècnica de xoc tèrmic a 42 ºC. Les cèl·lules transformades es seleccionaren en plaques amb medi de cultiu agar-LB que contenia ampicil·lina (100 μg/mL) i s’incubaren tota la nit a 37ºC.

Es realitzà un triatge de 96 colònies per PCR per identificar aquelles que haguessin inserit fragments superiors a 300 pb. Aquesta tècnica consisteix en prendre

les colònies i resuspendre-les individualment en 50 μL de tampó TRIS 10 mM i després desnaturalitzar-les a una temperatura de 95 ºC durant 10 minuts. Un cop desnaturalitzades, es centrifugaren durant 60 segons a 12.000 rpm per precipitar les restes cel·lulars fragmentades. Seguidament, s’empraren 1 μL de sobrenedant com a DNA motlle per fer una PCR estàndard en la qual s’utilitzaren els encebadors universals pel vector pJET. La mida de cada un dels productes amplificats es comprovà en gels d'agarosa al 1,5% i es triaren aquells que presentaven inserts de més de 400 bp.

En total s’obtingueren 63 clons positius, els quals foren purificats i seqüenciats en ambdues direccions emprant els encebadors universals pel vector pJET. Per visualitzar la cobertura inicial dels 63 clons, es feu servir com a bastida la seqüència parcial del mitogenoma de l’amfípode Parhyale hawaiiensis (Cook et al., 2005). Vist que les seqüències obtingudes no cobrien la totalitat del mitogenoma, es dissenyaren encebadors addicionals per cobrir els forats existents i s'empraren els fragments llargs de 10 Kb i 5 kb com a DNA motlle per a les noves reaccions de seqüenciació. La seqüència dels oligonucleòtids dissenyats per completar el mitogenoma de M. longipes s’inclouen a la Taula Addicional 1. Totes les reaccions de seqüenciació es feren segons el protocol desenvolupat a l’apartat 2.3.

2.5.1.2. Construcció de genoteques a partir de la fragmentació mecànica (Hydroshear®) de fragments de DNA obtinguts per long-PCR (Capítol III)

En el cas de les espècies M. repens, M. dominicanus i M. samanensis els fragments amplificats es fragmentaren mecànicament amb el sistema de Hydroshear®

(GeneMachines® Corporation, San Carlos, CA, USA). Aquest aparell fou dissenyat per fragmentar el DNA a partir de forces hidrodinàmiques i així crear un conjunt de fragments a l’atzar de DNA, independentment de la concentració de DNA, de la longitud del DNA i del volum de la mostra. El DNA passa a través d’una xeringa, la qual disposa d’un orifici estret que presenta un punt de contracció (Fig. 2.2). Depenent de la pressió i de la velocitat de bombeig a la qual es sotmeti el DNA, aquest quedarà més o menys fragmentat. Aquest sistema és per ara el millor ja que permet optimitzar la llargària de les lectures (reads) i, al mateix temps, el nombre de clons necessaris per a la construcció de llibreries genòmiques i així facilitar l’obtenció d’un contig (=conjunt ordenat de fragments on les seves seqüències solapen parcialment) sense forats i amb una alta cobertura. El principal avantatge és que aquesta tècnica no està esbiaixada tal

com succeeix en la digestió enzimàtica, la qual depèn de la localització dels llocs de reconeixement i del nombre de dianes de restricció. Amb aquesta metodologia hom pot triar la mida dels fragments tallats aplicant la pressió adequada. Malauradament, presenta una sèrie de desavantatges: la limitació de la mida dels fragments que pot generar, el tractament laboriós que necessita la preparació de la mostra abans de ser introduïda a l’aparell i la reparació dels extrems dels fragments un cop tallats per poder-ne ser posteriorment

clonats.

Per a la fragmentació es partí d’una concentració de 0.1 µg/mL en un volum de 110 µL, és a dir, 10 µg en 100 µL.

S’ajustaren els paràmetres per a què els fragments obtinguts fossin al voltant de 1,5 kb (25 cicles a una velocitat de nivell 5).

Després de la fragmentació es

dugué a terme una reacció de polimerització per reparar i restaurar els grups fosfats 5’

dels extrems dels fragments. Al producte obtingut rere la fragmentació s’hi afegí la següent barreja de reacció de polimerització: 13 µL de NEbuffer 2 10x (New England BioLabs ); 10 µL de dNTPs (2.5mM); 6 µL de la polimerasa de DNA Klenow I (5,000U/mL) (New England BioLabs); 2 µL de la polimerasa T4 (7.9 U/µL, Promega ).

La reacció s’incubà a temperatura ambient durant 1h. Per poder visualitzar i recuperar els fragments de mida òptima es realitzà un gel d’agarosa a l’1% i es carregà tot el producte fragmentat, fent-se córrer a 100 mV durant 20 min. Es retallà la taca difusa (smear) obtingut al voltant de 1,5 kb, i es purificà amb el kit comercial de columnes d’extracció de banda de Wizard® SV Gel & PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA). Tot seguit es quantificaren els purificats amb un espectrofotòmetre NanoDrop©

ND-1000. Per a la reacció de lligació s’utilitzà el kit comercial Fast-Link™ DNA Ligation Kit (Epicentre® Biotechnologies, Madison, USA). La reacció és dugué a terme amb els següents reactius: 1.5 µL de Fast-Link Buffer 10X, 0.75 µL d’ATP (10 mM), 2 µL d’enzim Fast-Link Lligasa (2 U/ µL), 100 µg vector de clonatge, 450 ng de producte tallat purificat i completant amb aigua MiliQ esterilitzada fins arribar a un volum final de 15 µL. Atès que la lligació entre extrems roms és més ineficient que per aquells extrems

Figura 2.2. Representació del procés de tall produït dins la xeringa de l’Hydroshear®. (1) DNA abans de fragmentar; (2) el DNA passa a través d’un orifici estret pel punt de contracció que produirà la fragmentació a l’atzar del DNA; (3) diferents fragments de DNA de diferents llargàries. (Imatge presa de www.jpgi.doe.gov)

cohesius es deixà que la reacció tingués lloc durant tota la nit a 16º C. Per a la transformació de les cèl·lules competents es va seguir la tècnica d’electroporació.

Aquesta tècnica consisteix en aplicar un xoc elèctric a les cèl·lules competents per tal d’augmentar la conductivitat elèctrica i permeabilitat permetent-ne així l’entrada del vector amb l’insert per la membrana temporalment afeblida. Per a la transformació s’empraren les cèl·lules competents de Escherichia coli (One-shot® TOP10 E. Coli cells, Invitrogen, Madison, WI, USA) amb 2 µL de producte lligat i es va fer servir l’electroporador de BioRad-Micropulser amb un voltatge de 1,8 kV. Posteriorment, les cèl·lules transformades es sembraren en un medi de agar-LB amb ampicil·lina (100 µg/mL) i s’incubaren tota la nit a 37ºC.

L’endemà es realitzà un triatge a l’atzar de 96 de les colònies obtingudes per PCR per identificar-ne aquelles que haguessin inserit fragments de més de 300 bp. Es seqüenciaren els inserts en una sola direcció fins a aconseguir una cobertura del contig com a mínim d’un 5x (Carapelli et al., 2008) (Taula 3.8, Cap. III). Malauradament, els clons seqüenciats no van ésser suficients per cobrir la totalitat del mitogenoma pel que es van haver de dissenyar encebadors específics per amplificar i seqüenciar les regions amb forats o de baixa cobertura. Totes les reaccions de seqüenciació es feren segons el protocol desenvolupat a l’apartat 2.4. Les seqüències dels oligonucleòtids dissenyats per complementar els mitogenomes de M. repens, M. samanensis i M. dominicanus es troben a la Taula Addicional 2.

2.5.2. Genoteques per PCR en emulsió i piroseqüenciació