Genoteques per PCR en emulsió i

Al començament del segle XXI, en la recerca d’abaratir els costs oferts per la seqüenciació capil·lar del DNA, es desenvoluparen metodologies alternatives basades en la nanotecnologia sorgint així els primers seqüenciadors de DNA en paral·lel d’alt rendiment (high-throughput). Entre les diferents tecnologies de seqüenciació de nova generació, la plataforma Roche (454) GS FLX Sequencer és sens dubte la que permet llegir els fragments més llargs, fins a 500 bp (Meyer et al. 2008) i des de mitjans de 2011 permet la lectura de fins a 1 kb (http://my454.com/index.asp). Aquesta segona generació de seqüenciadors són capaços de generar cents de milers de reaccions de seqüències en paral·lel gràcies a la creació d’una llibreria de DNA a partir d’una modificació de la PCR, coneguda com PCR d’emulsió, i a la immobilització dels

fragments amplificats en una superfície sòlida (microesferes d’afinitat específica).

Primer de tot es duu a terme la fragmentació mecànica del DNA en un procés conegut com a nebulització, on el DNA és fragmentat a l’atzar. De forma similar a l’Hydroshear®, la mida dels fragments obtinguts depèn de la pressió del gas del nebulitzador que condicionarà la velocitat a la qual passa la solució de DNA a través d’un petit orifici. La nebulització és un mètode senzill, ràpid, econòmic i requereix de poca quantitat de DNA. Un cop fragmentat el DNA es reparen els extrems dels fragments i es lliguen a dos adaptadors que es faran servir més endavant com a encebadors per l’amplificació i seqüenciació. Un dels adaptadors conté un marcatge de biotina a l’extrem 5’ que permetrà als fragments de DNA unir-se a les microesferes d’esptreptavidina. Un cop s’ha reparat el DNA, els fragments són desnaturalitzats, alliberant-se la cadena sense marcar, quedant d’aquesta manera un fragment de DNA monocatenari, aïllat i immobilitzat a la microesfera. Finalment les diferents microesferes són emulsionades juntament amb els reactius d’amplificació necessaris per què es dugui a terme la PCR

d’emulsió a cada una de les esferes.

La piroseqüenciació té lloc sobre una placa especial (PicoTiterPlate) que presenta uns diminuts pouets, de 44 micres de diàmetre, als quals sols hi entra una microesfera amb milions de còpies que han estat amplificades i a

on s’introdueixen els enzims i els productes per a realitzar la seqüenciació. Aquesta reacció química de seqüenciació consisteix en una tècnica de determinació del DNA a gran escala no fluorescent que mesura l’alliberament de pirofosfat a una reacció de polimerització mitjançant una sèrie de reaccions enzimàtiques acoblades que alliberen llum cada cop que s’incorpora un nucleòtid. El procés de piroseqüenciació es fa de forma paral·lela a cada un dels pous de la placa pel que cents de senyals són llegits ensems. Finalment, aquesta quimioluminescència produeix una imatge que es captada i interpretada per l’ordinador el qual proporciona la seqüència final de nucleòtids. A diferència dels cromatogrames obtinguts per una reacció de seqüenciació convencional on cada pic correspon a un nucleòtid, en el cas dels pirogrames produïts per piroseqüenciació el senyal lumínic emès per la cadena motlle és proporcional al nombre de nucleòtids d’una mateixa base incorporats a la cadena (Figura 2.3).

Figura 2.3. Exemple de pirograma on es veu que el senyal lumínic emès és proporcional al nombre de nucleòtids incorporats.

La resta de mitogenomes s’obtingueren per piroseqüenciació de llibreries a partir dels sistemes de Roche FLX/454 o el GS Junior. Tots els amplicons de PCR foren quantificats per un espectrofotòmetre NanoDrop© ND-1000 i es barrejaren en concentracions equimolars per a cada mostra a una concentració final de 300 ng/µl per fer-se servir com a substrat per a la preparació de la llibreria FLX (454 Life Sciences, Roche). Set dels 19 mitogenomes restants s’obtingueren a partir de la realització d’una llibreria de FLX (etiquetant prèviament per separat cadascuna de les set mostres).

Després de la reacció de piroseqüenciació per l’aparell Roche FLX/454 s’obtingueren les lectures de 200.000 seqüències corresponents a un octau de la placa PicoTiterPlate. El protocol per a la preparació del marcatge i de la llibreria seguit es pot consultar a Meyer et al. (2007). El programa Newbler Assembler (Margulies et al., 2005) classificà les seqüències obtingudes prèviament segons els seu etiquetatge (és a dir, per espècimen) i a continuació s’assemblaren les seqüències de cada espècimen per aconseguir el mitogenoma complet. Aquest programa és considerat el millor programa d’assemblatge de seqüències/genomes de novo (Kumar & Blaxter, 2010) i està dissenyat específicament per a dades generades per la tecnologia de Roche FLX/454.

Per a les 12 espècies restants es va explorar la possibilitat de realitzar una piroseqüenciació multiplex sense la necessitat de l’etiquetatge individual a cadascuna de les mostres, abaratint així el cost final (Timmermans et al., 2010). Primer de tot, es comprovà si s’assemblaven correctament les 200.000 lectures obtingudes de les set espècies al procés anterior (amb l’eliminació prèvia de l’etiquetatge específic). Aquesta exploració es va fer amb el programa CodonCode Aligner v 3.7. (CodonCode Corporation, Denham, MA, USA) al qual s’hi aplicà un mínim d’identitat (minimum match) del 95%. D’aquesta forma s’observà que la divergència trobada als mitogenomes de les diferents espècies era prou alta per reconstruir el mitogenoma sencer a cada una de les espècies sense la formació de quimeres. Aquestes 12 espècies es feren en dues tandes de 12 amplicons (un fragment de 10 kb i un altre de 4.5 kb per mitogenoma) purificats, quantificats i de concentracions equimolars a una concentració final de 100 ng/µL per mitogenoma. Per a cada sis mitogenomes es va construir una llibreria única que es seqüencià a un analitzador Roche GS Junior el qual donà un total aproximat de 100.000 lectures. Les seqüencies parcials de cox1, cob i rrnL prèviament amplificades i seqüenciades per la metodologia de Sanger (apartat 2.4.) i encebadors “universals”, foren inclosos al conjunt de lectures obtingudes per poder confirmar d’aquesta manera

el correcte assemblatge de cada uns dels mitogenomes i saber a quina espècie corresponia a cada contig/mitogenoma obtingut (similarment a les “seqüències de pesca” descrites a Timmermans et al., 2010). L’assemblatge es realitzà en el programa CodonCode Aligner v 3.7. Tant els assemblatges realitzats amb la plataforma FLX com la GLS es feren basant-se en un mínim de cobertura del 59x (Taula 3.8, Cap. III).

3. MÈTODES ANALÍTICS