Se note 2, side 33

As variações genéticas são responsáveis, em parte, pelas diferenças fenotípicas individuais e são resultado de variações nas sequências de ADN em determinados sítios (locus) do genoma de um organismo. Sempre que ocorre mais que uma variante (alelo) num locus diz- se perante um polimorfismo nesse locus.

Os polimorfismos podem variar desde a alteração num único nucleotídeo à alteração de um grande número de nucleotídeos, devido, entre outros factores, à selecção natural, tendo-se revelado, após a determinação da sequência do genoma humano e de vários outros organismos,

particularmente agentes infecciosos e vectores, importantes marcadores de

resistência/susceptibilidade, patogenicidade, resistência, filogenia, diversidade e diferenciação genética o que contribui para a compreensão da patogénese, epidemiologia e evolução (Bamshad & Wooding, 2003; McMihael, 1994; Yang et al., 2008).

Como marcadores podem ser utilizados individualmente ou em haplótipos em associação com mutações causadoras de doença no mapeamento de desequilíbrio de linkage (DL), particularmente de genes responsáveis por doenças complexas (Tishkoff & Varrelli, 2003) ou na análise da estrutura populacional.

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Recentemente, com os novos instrumentos disponíveis, nomeadamente as análises da expressão dos genótipos e os estudos de associação com todo o genoma (Genome Wide

Association Studies – GWAS), para a exploração de interacções complexas como as de

hospedeiro/parasita e co-evolução, a base subjacente a muitos polimorfismos relacionados com a susceptibilidade tem sido interpretada, ultrapassando-se assim as limitações impostas pela dinâmica de populações locais utilizadas em estudos efectuados por iniciativas muiticêntricas (Verra et al., 2009).

II.2.1.1 Polimorfismo num único nucleotídeo (single nucleotide polymorphism ou SNP)

O SNP, tal como o próprio nome sugere, envolve a alteração num único nucleotídeo. Este é normalmente substituído por um nucleotídeo diferente designando-se por substituição nucleotídica. Pode, no entanto, ocorrer uma inserção (in) (ganho) ou uma delecção (del) (perda) de um nucleotídeo denominando-se polimorfismo simples in(del), sendo que a maioria dos SNPs é responsável por alterações no sítio de restrição (polimorfismo no sítio de restrição - RPS) o que os elege como marcadores do tipo binário. A maior parte dos SNPs encontra-se em sequências de ADN não codificante, nos intrões ou em regiões intergénicas. Apenas uma pequena fracção ocorre em regiões codificantes (1,5%). Têm a vantagem de serem facilmente genotipados e de se encontrar em grande número no genoma (1 por cada 10 kb ou menos) (Wang et al., 1998).

Em consequência do acima exposto, os SNP têm sido amplamente utilizados como importantes marcadores em estudo de linhagens de isolados de determinados microorganismos, a nível do globo, tais como em Mycobaterium tuberculosis, VIH,

Mycobaterium lepraea, em estudos de patogenicidade e epidemiológicos. São também bons

marcadores para a identificação de espécies gémeas dentro dum complexo (Cornet & Collins, 1996; Scott et al., 1993) e desempenham um papel importante no mapeamento genético, em estudos de associação e linkage para o mapeamento de genes candidatos à susceptibilidade às doenças infecciosas. Além disso, são também usados em estudos de resistência a fármacos e insecticidas, uma vez que além de serem facilmente genotipados, permitem a análise de um grande número de amostras (Strachan & Read, 2004).

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II.2.1.2 Microssatélites

Os microssatélites, simple sequences repeats (SSR) ou short tandem repeats (STR) são sequências de ADN compostas por pequenos motivos, normalmente, um a seis pares de nucleotídeos, repetidos em linha, formando pequenos segmentos de 20-100 pb.

Podem ser classificados de acordo com a variação das repetições e o número de bases do motivo de repetição (Jarne & Lagoda, 1996). Assim são denominados de:

Dinucleótido perfeito ou ininterrupto quando o motivo de repetição é formado por 2

bases como em GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT, em que o GT aparece 10 vezes e se representa por (GT)10.

Trinucleótido perfeito ou ininterrupto, se o motivo de repetição é composto sempre por

três bases consecutivas como por ex.: AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC em que o

motivo AGC se repete 8 vezes e se representa por (AGC)8.

Tetranucleótido perfeito ou ininterrupto quando o motivo de repetição é sempre

composto por 4 bases como em GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA onde o

motivo GATA se repete 7 vezes (GATA)7.

Composto, se o a sequência é formada por sequência de motivos de repetição

diferentes, mas consecutivos tal como em CACACACACACAGAGAGAGAGA que é

representado seguindo o mesmo critério supracitado (CA)6 (GA)5 e

Interrompido ou imperfeito, sempre que ao longo da sequência exista uma ou mais

bases diferentes a interromper a sequência da repetição como no exemplo que se segue (GTGTGTGTGTCCAGCGTGTGTGTGT), em que existe uma interrupção a meio dos 10

motivos compostos por GT, pelas bases CCAGC, representando-se assim, neste caso, (GT)5 +

(GT)5.

Constituem um dos marcadores genéticos mais utilizados no mapeamento de linkage genético, em genética de populações tais como estudos de evolução e ecológicos e em identificação de paternidade, devido à sua ubiquidade, isto é, elevada distribuição ao longo do genoma (Tautz & Renz, 1984), ao elevado grau de polimorfismo, codominância (o que permite a discriminação entre homozigótico e heterozigótico), selectivamente neutrais (os locus são frequentemente conservados entre espécies relacionadas) e pela facilidade de screening uma vez isolados (Rubinsztein et al., 1995; van Oosterhout, 2004). Considerados uma importante ferramenta no mapeamento de genomas têm um papel relevante no diagnóstico biomédico de determinadas doenças genéticas, individualmente ou em haplótipo, dada a sua associação, através do desequilíbrio de linkage, com mutações causadoras de doenças, em regiões codificantes do ADN (Cankovic et al., 2006; Tishkoff & Verrelli, 2003). Entre outras

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atribuições, os microssatélites são usados na avaliação da história demográfica (verificação de

bottlenecks, por exemplo), na avaliação do tamanho efectivo de populações (Ne) e ainda na

avaliação da magnitude e direccionalidade do fluxo genético entre populações (Kayondo et al., 2005).

Os mais estudados são as repetições di-, tri- e tetranucleótidas e destas, as dinucleotídeas são as mais distribuídas ao longo do genoma, chegando a existir um locus em cada 30-50 Kb (Jarne & Lagoda, 1996). São, no entanto, raros nas regiões codificantes, excepção feita a algumas repetições trinucleotídeas localizadas em exões (ou muito próximo destes) que sujeitas a mutações de que resulta longas repetições ininterruptas e instáveis, associadas a determinadas desordens genéticas, tais como desordens neurológicas (Rubinsztein

et al., 1995) e cancro (Aaltonen et al., 1991; Thibodeau et al., 1993).

Com um mapeamento disponível para muitos organismos e com o desenho de primers para uma dada espécie, os microssatélites podem ser usados para a genotipagem de espécies bastante próximas (aparentadas) (Donnelly et al., 1999; Goldstein & Pollock, 1997; Schlötterer

et al., 1991; Stallings et al., 1991) com recurso às técnicas baseadas em polymerase chain reaction (PCR), uma vez que o tamanho dos alelos não ultrapassa os 500 pares de base (pb)

(Bruford et. al., 1996).

A estimativa de vários parâmetros populacionais, como sejam a diferenciação genética e o número de migrantes por geração, depende muito do modelo de mutação assumido para os marcadores genéticos, em estudo. Tendo em conta que a sensibilidade do modelo de mutação aumenta com a taxa de mutação que no caso dos microssatélites é extremamente elevada (Estoup & Cournet, 1999), torna-se portanto imperiosa a escolha do modelo de mutação a considerar.

II.2.1.2.1 Modelos teóricos de mutação

A mutação nos microssatélites normalmente envolve alteração no tamanho correspondente a uma repetição, podendo, por vezes, envolver várias unidades de repetição (Weber & Wong, 1993; Primmer et al. 1996).

Os principais mecanismos de mutação envolvidos na variação do comprimento dos microssatélites são o slippage da enzima DNA polymerase (inserção e delecção) durante a replicação do ADN (Levinson & Gutman, 1987) e o crossing over desigual, sendo o primeiro, a principal causa de alteração no número de repetições na sequência.

Vários são os modelos propostos para a mutação num locus microssatélite, sendo os

39 1964) que considera que as mutações podem envolver qualquer número de unidades de repetição e resultam sempre em novos alelos, não existentes na população; 2- o modelo de

mutação stepwise ou passo-a-passo (Stepwise Mutation Model – SMM, Kimura & Ohta, 1978)

que propõe que os novos alelos são gerados por inserções ou delecções (indel), em igual probabilidade, de uma unidade de repetição e 3- o Two-Phase Model (TPM) (Di Rienzo et al., 1994) - que considera que a maior parte das mutações correspondem a fracções (indel) com grande número de unidades de repetição, podendo ocorrer também indels iguais a uma unidade de repetição (este modelo congrega os dois outros). Sendo assim, de acordo com o IAM, todos os alelos diferem igualmente uns dos outros enquanto para o SMM, dois alelos que diferem numa unidade de repetição são mais fortemente aparentados que dois alelos que diferem por várias unidades de repetição (i.e. tem em conta o tamanho das repetições).

II.2.1.2.2 Limitações no uso de microssatélites

Embora apresentem uma ampla versatilidade, determinadas características podem limitar a sua utilização como marcadores para a estimativa de parâmetros de genética populacional. Assim, fenómenos como a homoplasia de tamanho, a restrição no comprimento dos alelos e alelos nulos (também ocorrem noutros marcadores), requerem atenção.

De acordo com Jarne & Lagoda (1996) e Estoup & Cornuet (1999) dois alelos dizem-se homoplásicos quando são idênticos no estado (IIS)14 mas não idênticos por descendência (IBD)15. A homoplasia relaciona-se com a forma como os novos alelos são produzidos e consequentemente com o modelo de mutação assumido. Considerando o modelo IAM, a homoplasia de tamanho não deveria acontecer, uma vez que cada novo alelo originado por mutação é diferente dos já existentes na população. Em contrapartida, quaisquer dos outros modelos (SSM e TPM) podem gerar homoplasia de tamanho, uma vez que uma mutação pode gerar alelos cujo tamanho já exista na população. A homoplasia de tamanho está também dependente da taxa de mutação no locus e do tempo de divergência entre populações, sendo maior a possibilidade da sua ocorrência quanto maiores forem esses dois fenómenos.

Uma vez que os loci microssatélites são caracterizados por elevadas taxas de mutação16

(Weber & Wong, 1993) com provas directa e indirecta do envolvimento de todos os modelos

SMM, TPM (IAM em menor escala) e existem processos selectivos que actuam ao nível de

tamanho do alelo, reduzindo o número de possíveis estados alélicos, uma grande quantidade de homoplasia de tamanho é esperada na maior parte dos loci (Nauta & Weissing, 1996), o que

14 _{IIS – (Identical-In-State): alelos comuns na população mas com origens diferentes} 15 _{IBD – (Identical-By-Descent): alelos originados dum ancestral comum, sem mutações.} 16 _{A taxa de mutação é de 10}-2_-10-5_{, por locus por geração, em humanos.}

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poderá ter implicação nas estimativas de diferenciação genética (não reflectindo os níveis reais de sub-estruturação).

A limitação no tamanho do alelo é evidenciada pelo facto de a maioria dos alelos microssatélites apresentar dimensões quase nunca superiores a uma dezena de unidades de repetição (Estoup & Cornuet, 1999; Goldstain & Pollack, 1997), sugerindo que existe uma restrição na expansão das mesmas. Teoricamente, se durante um processo de mutação, dependente apenas do número de motivos de repetição, houvesse mais ganhos que perda de motivos, deveria haver uma expansão da sequência para um número infinito de repetições, o que não acontece, excepção feita, como já referido, a poucas sequências com um vasto número de unidades de repetição em regiões teloméricas associadas a doenças (Aaltonen et al., 1993; Caskey et al., 2002; Thibodeau et al., 1993).

Uma outra limitação evidente é a ocorrência frequente de alelos nulos nos loci microssatélites (Callen et al., 1993). Alelos nulos são alelos que não amplificam devido a mutações na região flanqueante da sequência complementar ao primer usado na amplificação dum locus. Estas mutações podem conduzir a uma redução ou perda completa de produto amplificado para esse alelo. Normalmente um locus com alelos nulos fornece uma frequência de produto de PCR negativo muito superior ao normal. A presença de um alelo nulo num heterozigótico pode ser erroneamente interpretado como um homozigótico, traduzindo-se num déficit de heterozigóticos comparado com a frequência de heterozigóticos esperados (o que poderá não ser real).