Forskjellige ferdigvarer, ikke ellers nevnt

As análises moleculares das amostras humanas foram feitas no IHMT, no IPATIMUP e no Centro de Investigação em Antropologia da Saúde (CIAS) da Faculdade de Ciências Tecnológicas da Universidade de Coimbra, enquanto as moleculares de mosquitos foram feitas no IHMT.

III.3.1 _{Pesquisa de dados de ADN genómico humano e desenho de}

primers

Dados sobre a sequência de ADN genómico e a posição de SNP ou STR conhecidos foram obtidos do sítio na Web da ENSEMBL (http://www.ensembl.org/) e quando foi necessário o desenho de primers este foi feito com o software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3).

III.3.2 _{Técnicas usadas na pesquisa de mutações, polimorfismos binários}

e análise de STR ou microssatélites.

III.3.2.1 ASA-PCR (allele-specific amplification-PCR)

Esta é uma técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) baseada na análise da presença de SNPs conhecidos ou de outras variações em sequências de ADN dum sistema bialélico, numa única reacção apenas. Nesta reacção, primers complementares para uma dada sequência só não emparelham com a sequência se houver uma mutação na extremidade 3’.

III.3.2.2 PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism)

A técnica consiste na amplificação dum fragmento que depois é digerido com endonucleases ou enzimas de restrição que catalisam clivagens em sequências nucleotídicas específicas (zonas alvo), gerando fragmentos definidos (normalmente complementares em dimensão) que podem ser separados em gel agarose ou poliacrilamida conforme o seu peso molecular.

III.3.2.3 SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

O SSCP é uma técnica que consiste numa desnaturação a quente com formamida e estabilização das cadeias do produto amplificado, uma vez que a molécula de ADN em cadeia

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simples assume uma estrutura tridimensional estabilizada por ligações intramoleculares cuja configuração depende da sequência dos seus nucleótideos. Assim sendo, fragmentos com diferentes sequências (selvagem e mutado e.g.) submetidos a electroforese em gel não desnaturante (gel que permite a migração do ADN como cadeia simples), apresentarão uma mobilidade que irá depender não apenas do tamanho da cadeia, mas também da forma que a molécula assume.

Todas as amplificações foram efectuadas num termociclador T1-Thermocycle da Biometra.

III.3.3 _{Revelação dos produtos amplificados}

A revelação dos produtos amplificados foi feita por electroforese em:

 Gel agarose 2% ou 1,5% (no caso do HBB, G6PD e identificação e genotipagem de A. arabiensis) em tampão TBE;

 Mini-gel vertical de poliacrilamida (para as repetições T10/19, 1705A>C e 1456C>T do gene PKLR) e,

 Gel horizontal de poliacrilamida (para os STRs do gene PKLR), ambos corados com nitrato de prata.

Gel agarose

De acordo com a concentração, a quantidade de agarose em gramas é dissolvida a quente em TBE 1x (Tampão Tris Borato EDTA) adicionando-se antes do início da

polimerização 2μl de BrET (10µg/ml) por cada 100ml de gel. Este é vertido para um tabuleiro

e sobre ele se colocam pentes que permitem a formação de poços. Após a polimerização do gel à temperatura ambiente, são carregados os produtos amplificados (1µl de cada) e um marcador

de peso molecular padronizado de 100pb (MassRuler™ DNA Ladder), para controlo do

tamanho dos fragmentos.

A visualização posterior dos fragmentos foi feita num transiluminador com luz ultravioleta (UV) acoplado a um sistema de documentação fotográfico (UVIDOC); sempre que o tampão utilizado na mistura da reacção não fosse corado, era adicionado ao produto

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Mini-gel vertical de poliacrilamida

Este mini-gel consiste numa mistura inicial (gel de separação), de acordo com a

concentração do gel, de acrilamida – bisacrilamida (37,5:1; 40% p/v), 1,15ml de glicerol 87%

e 0,55ml de TBE10x a pH 8.3, ao qual se misturou 5,3ml água destilada (dH2O) até perfazer

um volume de 10ml, 16µl de persulfato de amónia a 25% (APS 25%) e 10µl de N,N,N’N’-

tetrametil-etilenodiamina (TEMED) como polimerizantes. A mistura é vertida para um aparato

apropriado e sobre o gel é vertida dH2O ou etanol absoluto para que a polimerização se faça

mais rapidamente e a superfície fique horizontal. Estando o gel polimerizado, uma segunda camada constituída pelos mesmos componentes (mas em concentrações diferentes: 1ml do gel

de separação sem os polimerizantes, 0,5ml dH2O e 0,5µl de APS e 0,5µ de TEMED,

adicionados no momento da aplicação) é vertida sobre a primeira, colocando-se os pentes que, após polimerização, formam poços por onde são depositadas as amostras. A electroforese foi feita em tampão TBE 0.5× durante 3h 45 a 200 V. De seguida, procedeu-se à coloração das bandas de ADN com nitrato de prata.

Gel horizontal de poliacrilamida

Neste gel usou-se 4,4ml poliacrilamida (T9%/C5%), 0,35ml de glicerol 100% (v/v), 0,25 ml de sodium persulphate a 1% (SPS 1%) e 0,01ml de TEMED. Uma folha de Gelbond é colocada entre dois vidros, funcionando um deles como molde para formação dos poços onde

as amostras são carregadas após a polimerização do gel; este é colocado numa placa com dH2O

na tina de electroforese, mas com pontes de papel de filtro mergulhadas num tampão 0,125M Tris/Glicina a pH8,8. A primeira ponte (a mais próxima das amostras) é embebida em tampão azul de bromofenol para permitir a visualização da migração. A electroforese foi feita a 150V durante cerca de 1h 30´ e a coloração foi feita com nitrato de prata.

Coloração com nitrato de prata

Para a coloração, mergulhou-se o gel em ácido acético 10% durante 20´, lavou-se duas vezes com água destilada e de seguida foi colocado numa tina com 100ml de nitrato de prata 1% e 150µl de formaldeído 37% durante 30´. Findo o tempo, procedeu-se de imediato a nova lavagem e o gel foi então mergulhado numa parte duma solução contendo 100ml de carbonato de sódio 3%, 150µl de formaldeído 37% e 20µl tiossulfato de sódio 10%, até ao início da visualização de bandas, altura em que a solução é vertida e se adiciona o volume restante para a revelação total, sendo a reacção bloqueada com ácido acético 10% durante 30´´; o gel é então

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Secagem

Posteriormente à remoção da dH2O, os géis foram colocados sobre papel de filtro e com uma folha de acetato sobre a outra face foram secos num secador para géis a 80ºC durante 2 horas.

III.3.4 _{Sequenciação}

A técnica baseia-se na incorporação de dideoxinucleótidos (ddNTPs) específicos, sem o grupo 3´-OH, marcados com fluoróforos (grupo químico capaz de fluorescer) numa reacção de sequenciação em que se utiliza um primer específico do fragmento que se quer sequenciar, tampão e Taq Polimerase. A revelação por electroforese em finos capilares, atravessados por um feixe laser, foi feita num ABI 3100 (Applied Biosystems) e a análise das sequências com o

software Sequencing Analysis 3.7.3. num procedimento semelhante ao esquematizado na Fig.

III.2.

Fig. III.2 Sequênciação automática (adaptado de

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg).

Para a confirmação de alguns resultados de PCR-FRLP efectuados no IHMT, os produtos amplificados e purificados, bem como os primers de interesse foram enviados para uma empresa de biotecnologia (Macrogen) para sequenciação. Neste caso, os resultados são- nos remetidos sob a forma de electroferograma para análise e interpretação dos resultados. O alinhamento das sequências (sense e anti-sense,) para cada amostra e a sua correcção (eliminação de gaps) foi feito usando o programa ClustalW disponível no software Bioedit

Sequence Alignment Editor (Hall, 1999), tendo sido determinados os genótipos por observação

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III.3.5 Genotipagem de STRs ou microssatélites

Esta foi feita com recurso a Single ou Multiplex- PCR com primers específicos em que a sequência forward (F) ou reverse (R) para cada par de primer é marcada com fluorocromos de cores diferentes a fim de permitir a identificação dos tamanhos dos fragmentos amplificados (em pares de base) por electroforese capilar em sequenciador automático. Os resultados são analisados com um software apropriado que permite a leitura do tamanho aproximado dos fragmentos em pares de base com base num marcador que é adicionado à mistura da reacção desnaturante. No caso dos microssatélites do gene PKLR, usou-se dois sequenciadores diferentes o ABI 3100 e 3130 (Applied Biosystems, USA) e os resultados foram analisados no

software GeneScan 3.1.2.

Para os microssatélites de A. arabiensis a genotipagem com recurso a um sequenciador

automático ABI 3730 (Applied Biosystems, USA) foi feita por uma empresa comercial (Yale’s

DNA Analysis Facility em Science Hill, USA) e a análise dos electroferogramas pelo software

GeneMarker 1.4 (SoftGenetics, USA).