3.1.1 Recrutamento da série 1 LFS/LFL
Inicialmente 45 pacientes índice não relacionados foram incluídos, todos com
o diagnóstico clínico de LFS/LFL pelos diferentes critérios da síndrome clássica
(LFS) (LI et al. 1988) ou variante, de Birch et al. (1994) e de Eeles (1995) (LFL-
Birch ou LFL-Eeles). Estes pacientes foram submetidos ao rastreamento prévio da
mutação no gene TP53, em projeto aprovado no Comitê de Ética e Pesquisa da
Fundação Antonio Prudente, em 30.09.2003, sob o número 531/03 (Anexo 1). Os
pacientes foram atendidos entre os anos de 1999 e 2004 no Departamento de
Oncogenética do HACC, São Paulo, no Serviço de Genética Médica do HCPOA, e
na Divisão de Genética Médica do INCA, Rio de Janeiro. Realizamos a detecção da
mutação germinativa no gene TP53 no Grupo de Carcinogênese Molecular
(Molecular Carcinogenesis Cluster – MOC), IARC, Lyon, França, sob a orientação
do Dr. Pierre Hainaut, diretor do laboratório.
Todos os 45 pacientes-índice envolvidos no projeto de mestrado, referidos
aqui como Série LFS/LFL-1, foram incluidos neste estudo após a reconvocação dos
pacientes e a assinatura do TCLE (Anexo 2). As amostras foram avaliadas para o
Os familiares provenientes destas famílias que quiseram participar foram
incluídos após a assinatura do TCLE. Cento e dois familiares foram avaliados para os
polimorfismos do gene TP53 (PIN2, PIN3 e PIN4) e MDM2 (SNP309). Todos os
familiares nos quais havia sido detectada mutação no gene TP53 no paciente-índice
foram avaliadas para a presença da mutação pontual. Dentre os familiares avaliados,
57 eram provenientes da mesma família portadora da mutação R337H (família Y12).
3.1.2 Recrutamento da série 2 LFS/LFL
Vinte famílias que receberam diagnóstico clínico da LFS/LFL, provenientes
do sudeste do Brasil (dos estados de São Paulo e Minas Gerais) e recrutadas no
Departamento de Oncogenética do HACC no período de março de 2005 a janeiro de
2007, foram incluídas (Série 2 LFS/LFL). Vinte e seis novas famílias com
diagnóstico clínico de LFL provenientes do Serviço de Genética Médica do HCPOA
no mesmo período foram incluídas. Três familiares optaram por participar,
totalizando 29 pacientes incluídos (Serie 2 POA LFS/LFL). Todos assinaram o
TCLE e foram analisados para mutações germinativas e polimorfismos no gene
TP53, além do polimorfismo SNP309 do gene MDM2.
Um total de 91 pacientes-índice foram incluídos neste estudo e de 119
familiares em risco, finalizando uma amostra de 210 pacientes (Quadro 5). Todos
foram avaliados clinicamente e receberam aconselhamento pré-teste antes de ser
realizada a coleta de sangue para a realização do teste genético. Todos os indivíduos
que demonstraram voluntariedade em participar do estudo assinaram o TCLE e uma
realizado pelas equipes de aconselhamento genético dos Departamentos de
Oncogenética nos quais os pacientes foram recrutados (Hospital do Câncer A. C.
Camargo e Hospital de Clínicas de Porto Alegre). Todos os supervisores do
procedimento de aconselhamento genético eram médicos geneticistas clínicos
devidamente treinados especificamente em oncogenética e diretamente envolvidos
neste projeto. O teste preditivo não foi oferecido para menores de 18 anos.
Quadro 5. Pacientes com diagnóstico de LFS/LFL incluídos no projeto
Série (ano ao diagnóstico) Pacientes Familiares em risco Total
Série 1 LFS/LFL (1999 a 2004) 45 116 151
Série 2 LFS/LFL (2005 a 2007) 20 - 20
Série 2 LFL/POA 26 3 29
Total 91 119 210
Os heredogramas das famílias avaliadas foram atualizados na ficha clínica de
cada paciente e registrados eletronicamente com o auxílio do programa Progeny
Lab7 (Progeny Genetics).
Uma amostra de 300 controles provenientes de Porto Alegre foi incluída. A
amostra era composta por mulheres não selecionadas para historia familial de câncer,
provenientes de um estudo populacional conduzido na região, o Núcleo Mama Porto
Alegre (NMPA).
3.2 Extração de DNA
Amostras de 20 mL de sangue periférico foram coletadas de maneira
linfócitos ocorreu em um período inferior a cinco dias após a coleta e foi realizada
conforme o método descrito por English e Andersen (1974). O sangue foi transferido
para tubos Falcon de 50mL. O DNA foi extraído conforme o método de fenol-
cloroformio/álcool isoamilico (Miller et al. 1988). De acordo com o protocolo, as
amostras foram centrifugadas (10 minutos a 2.000 rpm, temperatura ambiente) e o
halo linfocitário ou buffy coat foi aspirado(com pipeta Pasteur) e transferidas para
um tubo Falcon de 15 mL. Foi realizada lavagem com 10 mL de PBS 1X seguida de
centrifugação (15 minutos a 2.000 rpm) e descarte do sobrenadante. Dois pellets de
linfócitos foram separados e um deles foi ressuspendido em 1,5 mL de PBS 1X, e
estocado a -70oC.
O outro pellet foi centrifugado em tubo Falcon de 15 mL por 15 minutos a
2.000 rpm. Ao pellet, foi acrescido 2 mL de tampão TES (Tris HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 50 mM, SDS 0,5%) e 20 μl de Proteinase K (20 mg/mL; Concentração final = 200 μg/mL). A amostra foi incubada a 55ºC por 12 horas e, no caso de digestão incompleta, foram acrescentados 5 a 10 μl de Proteinase K e novamente incubado a 55ºC por mais algumas horas até a digestão total. Foram adicionados 2 mL de fenol
equilibrado (pH 8.0), seguidos de agitação durante 5 minutos (agitador mecânico).
Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 3000 rpm, a 4ºC. O
sobrenadante foi separado (utilizando pipeta Pasteur estéril de plástico) e colocado
em tubo plástico contendo 2 mL de clorofórmio-álcool isoamílico. Os tubos
contendo as amostras foram agitados por 5 minutos e centrifugados por mais 15
minutos a 3000 rpm. Neste momento foi repetida a extração por clorofórmio-álcool
isoamílico e coletado o sobrenadante para um tubo corex estéril. Foi adicionado 1/10
etanol absoluto gelado. Os tubos foram vedados com (Parafilm®) e incubados por 1
hora a – 70ºC. Ao término, as amostras foram balanceadas com etanol absoluto e
centrifugadas por 30 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi descartado. As
amostras foram lavadas com etanol 70% e centrifugadas durante 10 minutos. O
sobrenadante foi desprezado e o pellet seco naturalmente. O DNA extraído foi eluído
e ressuspendido em uma solução de TE 1X, para um volume final de 300 mL e
incubadas a 65ºC durante 30 minutos para desativar DNAses.
Após a extração, as amostras de DNA foram quantificadas (Nanodrop –
Thermo Scientific) e armazenadas a 4oC. No caso das amostras provenientes de outros estados do Brasil, o DNA foi extraído no centro de origem. As amostras
levaram um período máximo de sete dias entre o envio e o seu recebimento e,
quando recebidas foram imediatamente armazenadas a -20oC.