Estudos bioquímicos mostraram que a mutação R337H se localiza em uma
alfa-hélice crítica para a estabilidade de dímeros da proteína p53 (Digiammarino et al.
2002). A arginina 337 tem um papel na doação da ligação de hidrogênio (para D352)
que estabiliza a dimerização. A substituição da Arginina por Histidina nessa posição
resulta em sensibilidade ao pH para doação da ligação de hidrogênio, correlacionando
com o estado de protonação da Histidina. Uma pequena mudança no pH dentro da
faixa fisiológica de 7,5 para 8,0 leva ao desdobramento do dímero, prevenindo por
conseguinte uma ligação de DNA de alta afinidade e, presumivelmente, a atividade de
transcrição da p53. Apesar de fatores que regulam a dinâmica da dimerização da p53
e sua dependência do pH ainda serem desconhecidos, esta característica molecular
ambiente intracelular, que poderiam impactar a estabilidade do dímero da p53.
Portanto, R337H representa um paradigma para uma mutação com penetrância
condicional. Esse conceito explicaria porque, no heredograma apresentado na Figura
13, alguns indivíduos com mutação não desenvolveram câncer, incluindo um paciente
que aos 93 anos permanece assintomático, enquanto o paciente-índice desenvolveu
várias lesões primárias.
5.3.2.1 Hipótese sobre o espectro tumoral apresentado nas famílias R337H
O códon 337 pertence a uma região do gene TP53 que codifica o domínio de
oligomerização. Menos de 2% de todas as mutações em TP53 descritas até 2004
ocorreram neste domínio, tanto germinativas como somáticas. Existem evidências
funcionais de que a mutação R337H é patogênica e que leve ao fenótipo LFS/LFL
(Kato et al. 2003; Varley et al.2001). Desde a identificação inicial deste mutante em
2001 por Ribeiro et al., o R337H atraiu muito interesse, principalmente de
pesquisadores da área da biologia estrutural e entre os bioquímicos.
Os primeiros experimentos realizados pelo grupo de Ribeiro em culturas de
célulaS mostraram que o p.337 da proteína p53 se comportava como “wild-type”, ou
seja, tinha sua função preservada. Em 2003, Digiammarino et al. desenvolveram um
ensaio para avaliar o efeito mutagênico desta proteína 337H. Os estudos conduzidos
foram exclusivamente estruturais e bioquímicos, indicando que R337H formava
oligômeros somente se houvesse condições de pH específicas.
Em pH 7, a proteína se comportaria como “wild-type” p53 e formaria pontes
doação de próton necessária para a formação da ponte de hidrogênio com o resíduo
D352 no outro monômero ( Figura 7A) Assim, o dímero de moléculas de p53 não
poderia manter-se estruturalmente, impedindo a formação do tetrâmero. Apesar da
proteína R337H permanecer idêntica à proteína “wild-type”, com os domínios de
ligação ao DNA e de transativação intactos, ficaria impossível a formação do
tetrâmero que é a conformação que possibilita a p53 ter afinidade ao DNA e agir
como fator de transcrição.
Desde a sua descoberta, acreditava-se que p.R337H pudesse ser pH-
dependente in vivo, com atividade biológica ou inativo conforme as alterações de pH
intra-celular. Assim, a partir do estudo de Ribeiro, poderia-se concluir que p.R337H
perderia a sua atividade apenas em células e tecidos nos quais ocorresse alterações no
pH que chegassem ao pH 8 ou mais, enquanto que nas outras permaneceria com a sua
função preservada.
No entanto, pouco se sabe sobre as alterações de pH em células. Alguns fatos
são conhecidos, como o aumento de pH celular durante a apoptose, quando a célula
pode aumentar seu pH até 8,5 ou mais. Digiammarino et al. (2003) sugeriram que tais
trocas poderiam contribuir para o desligamento da função de p.R337H e assim
diminuindo a apoptose. Este fato resultaria na manutenção de pools de células
anormais que teriam sido eliminadas caso a p53 estivesse intacta durante o
remodelamento do órgão. A supra-renal, ou glândula adrenocortical, é um órgão no
qual ocorre remodelamento perinatal a partir de apoptose e a persistência deste pool
de células anormais predisporia ao aumento de risco para ADR precoce.
Atualmente, faltam dados experimentais in vivo que confirmem esta hipótese.
TP53 tenham uma glândula adrenocortical maior ou com a presença de massas. Não
existe sequer uma prova direta de que o pH seja efetivamente o gatilho biológico da
inativação da proteina p.R337H. Estudos experimentais mais aprofundados utilizando
linhagens celulares são necessários para a descrição das condições nas quais a
p.R337H muda da sua forma ativa para inativa. Em particular, seria de grande
interesse a determinação da magnitude da resposta supressora de p53 induzida por
este mutante após diferentes formas de estress geenotóxico.
A atividade de condicional da p.R337H pode fornecer a base para a
compreensão da tendência apresentada por este mutante de aumentar o risco para
alguns tumores característicos da LFS. A atividade variável da p.R337H seria possível
de ser compreendida se o risco para todos os outros cânceres do espectro LFS fosse
diminuído, como ocorre quando há mutações na região de “hotspot”. No entanto não é
o que verificamos nas famílias brasileiras que apresentam um espectro tumoral
semelhante ao de outras mutações germinativas em TP53 (Achatz et al. 2007). Além
disso, há uma maior incidência de câncer de tireóide e renal nas famílias brasileiras
portadoras da p. R337H, demonstrando que em certos tecidos este mutante possa ter
um efeito mais pronunciado do que as mutações no “hotspot” de TP53. Este é um
aspecto que ainda não foi suficientemente bem estudado ou compreendido e que
poderia ser abordado a partir do desenvolvimento de um modelo animal ou cultura
O estudo das famílias brasileiras com a mutação R337H demonstrou uma
grande variedade de tumores apresentados pelos portadores. Dentro de uma mesma
família, foram detectados indivíduos que eram portadores assintomáticos e que
permaneceram sem a manifestação de tumores até uma idade avançada (Figura 13).
Em uma mesma família foram detectados dois pacientes portadores do mutante
R337H que aos 93 e aos 77 anos continuam assintomáticos, enquanto outros
apresentaram tumores em diversas idades. Este fato indica que a mutação R337H
isoladamente não confere um risco semelhante aos outros mutantes do gene TP53,
pois nesta família não se verificou a penetrância esperada de 90% até os 60 anos.
Outros fatores pessoais devem ser críticos no desenvolvimento de câncer nos
portadores. Entre os possíveis fatores envolvidos, podem-se considerar fatores
genéticos e epigenéticos. Modificadores epigenéticos são mais difíceis de avaliar, pois
incluem a interação com o ambiente (estilo de vida, dieta e fatores ambientais) assim
como fatores psicológicos que modulariam a atividade da proteína R337H.
Buscamos abordar esta questão através da análise de possíveis modificadores
genéticos, os polimorfismos PIN2, PIN3 e PEX4 de TP53 e do SNP 309 de MDM2.
Estes dados serão discutidos na próxima sessão. Buscamos ainda modificações
relacionadas a dois polimorfismos mais freqüentes do gene AKT, porém após a
avaliação inicial, nenhum resultado mostrou ser estatisticamente significante.
Desta forma, uma série de fatores “condicionais” pode ser necessária para que
o mutante R337H exerça sua função deletéria aumentando efetivamente o risco para o
câncer. Este conceito pode ser nomeado como “penetrância condicional”. O termo
disso, na penetrância parcial pode-se verificar um fenótipo leve devido à inativação
muitas vezes parcial da proteína. A mutação condicional difere da parcial pelo fato de
que o fenótipo pode diferir inteiramente de uma família portadora para outra, mesmo
frente à mesma mutação. O mutante condicional vai reter certo grau de atividade que
irá diferir conforme os fatores condicionais e não de acordo com a própria mutação.
Assim, estudos futuros serão necessários para determinar as condições que irão
modular a penetrância de R337H. A monitoração destas condições é fundamental para
a predição dos fatores de risco individuais e familiares envolvidos. É importante notar
que, no caso de condições epigenéticas, a detecção destes fatores pode fornecer a
possibilidade da identificação precoce dos mesmos e identificação do risco antes
mesmo do diagnóstico precoce de lesões malignas.
5.4 Impacto populacional do mutante R337H: conseqüências para a saúde