Sammenligninger mellom trenernes læringsforståelse

C. jejuni expressa vários determinantes potenciais de virulência dos quais os mais bem caracterizados incluem a motilidade mediada por flagelo, adesinas e proteínas que lhe conferem capacidade invasiva (DASTI et al., 2010; ZIPRIN et al., 2001). Uma grande soma de tempo, trabalho e investimento foram requeridos para o sequenciamento do genoma completo da cepa NCTC11168 de C. jejuni, o que permitiu a caracterização de seu DNA circular, com aproximadamente 1,6 milhões de pares de bases, e da presença de sequências hipervariáveis que codificam proteínas responsáveis pela biosíntese ou modificação de estruturas de superfície (PARKHILL et al., 2000). Em seguida, foram sequenciadas duas cepas (81-176 e CG8486) isoladas de pacientes com diarreia inflamatória grave, e tais estudos, em conjunto com o trabalho de Fouts et al., forneceram pistas sobre características importantes do gênero Campylobacter, como seu metabolismo peculiar e seu leque de proteínas determinantes na montagem ou modificação das estruturas de superfície altamente variáveis como LOS e CPS (FOUTS et al., 2005; HOFREUTER et al., 2006; POLY et al., 2007).

A informação genômica, juntamente com alguns estudos comparativos (DORREL et al., 2001; LEONARD et al., 2004; POLY; THREADGILL; STINTZI, 2004; 2005) revelou ainda um notável grau de diversidade entre os isolados de C. jejuni, levando-se à hipótese de que tal diversidade seja, em grande parte, responsável pelas distintas propriedades patogênicas dos diferentes isolados de C. jejuni (HOFREUTER et al., 2006). Os isolados clínicos, por sua vez, variam entre si na extensão em que apresentam e/ou expressam certos fatores de virulência (BELTINGER et al., 2008).

Ainda, ao contrário de outras bactérias causadoras de diarreia, C. jejuni não apresenta um grande número de fatores de virulência ditos ‘clássicos’ como certas exotoxinas e sistemas de secreção tipo III para injeção de proteínas efetoras em células hospedeiras (THOMPSON; GAYNOR, 2008). Assim, são considerados fatores de virulência representativos na patogênese das campilobacterioses os genes que codificam proteínas envolvidas em etapas como: adaptação ao estresse, motilidade, adesão, invasão e produção da toxina distensora citoletal (CDT – cytolethal distending toxin). No Quadro 1, estão listados os principais fatores de virulência de C. jejuni.

Quadro 1: Fatores de virulência bacterianos envolvidos na patogênese das campilobacterioses.

Suposta ação Proteína bacteriana Importância

Resposta ao estresse

DnaJ Resposta ao choque térmico

RacR Regulador de sinalização temperatura- dependente

-glutamiltranspeptidase Utilização de glutamina e glutationa _{como fonte de carbono}

Motilidade, adesão e invasão

Flagelina

Mutantes não móveis apresentaram menor aderência e menor capacidade

de invasão

pldA

Fosfolipase de membrana externa envolvida com a invasão de células do

hospedeiro

CiaB Antígeno de invasão, liberado por aparato de exportação flagelar

Toxina CdtA, B, C

Subunidades A e C transportam a subunidade B ao núcleo da célula hospedeira. CdtB causa parada do ciclo celular, apoptose e secreção de

IL-8 Fonte: Própria autora. Adaptado de: DASTI et al., 2010; ZIPRIN et al., 2001.

C. jejuni encontra uma variedade de hábitats ambientais que variam desde o intestino de animais e seres humanos, até água livre e superfície de alimentos. A sobrevivência nas diferentes condições que serão encontradas nesses hábitats requer uma intrincada rede de mecanismos de adaptação que permitem que esse micro-organismo seja capaz de alternar o uso de diferentes fontes de nutrientes e de suportar alterações de temperatura ou disponibilidade de oxigênio – variações encontradas no intestino dos diferentes hospedeiros (VAN PUTTEN et al., 2009). Os genes que codificam proteínas responsáveis pela resposta ao estresse (gerado pela ubiquidade do gênero) são, portanto, considerados alguns dos genes

relacionados à virulência de C. jejuni. Os genes racR e dnaJ seriam, portanto, importantes para a adaptação de C. jejuni, uma vez que são presumivelmente expressos em resposta às variações nas condições encontradas na microbiota intestinal dos hospedeiros, como as diferenças entre as temperaturas corporais de reservatórios e humanos (KONKEL et al., 1998; BRÁS et al., 1999).

Aderência ao epitélio intestinal, invasão e colonização são passos fundamentais para a patogênese da campilobacteriose intestinal por C. jejuni. Elementos estruturais como os flagelos de C. jejuni têm um papel importante tanto no contato com o epitélio, como na invasão e internalização, parâmetros marcadamente reduzidos em experimentos in vitro que se utilizaram de bactérias C. jejuni que não possuíam o gene que codifica a flagelina, ou seja, mutantes flaA- (WASSENAAR, 1997).

Foi observado que a cepa NCTC11168V26 de C. jejuni, um colonizador pobre em comparação com os outros isolados de C. jejuni em aves, não secretam a proteína Cia, o que sugere que Cia apresenta um papel importante na colonização de aves de corte (BISWAS et al., 2007). O gene ciaB, por sua vez, codifica uma proteína de invasão denominada Campylobacter invasion antigen B que confere capacidade invasiva, visto que C. jejuni mutantes sem o gene ciaB (ciaB‘null’) mostraram reduzida internalização (KONKEL et al., 1999, 2004; DASTI et al., 2010). Ainda, Siegesmund et al. (2004) demonstraram que a infecção por C. jejuni selvagem induziu a apoptose de 63% das células da linhagem celular monocítica THP-1, enquanto a infecção com uma cepa mutante, que não secretava CiaB, ocasionou apoptose em apenas 34% dos monócitos de mesma linhagem celular, sugerindo assim, um papel de CiaB na indução de apoptose das células de defesa do hospedeiro (SIEGESMUND et al., 2004).

O gene pldA codifica uma proteína envolvida na síntese de uma fosfolipase de membrana externa que também tem sido relacionada com a invasão celular (ZIPRIN et al., 2001). Fosfolipases são também associadas com a lise de eritrócitos em alguns agentes patogênicos bacterianos. Mutantes pldA- demonstraram apresentar atividade hemolítica reduzida em comparação com cepas selvagens (GRANT et al., 1997).

O gene plasmideal pVir foi correlacionada com a capacidade do C. jejuni de aderência e invasão in vitro e parece aumentar a virulência in vivo (BACON et al., 2000). Tracz et al. (2005) demonstraram que a detecção de pVir ocorreu em infecções muito invasivas, com características de disenteria.

Ainda de grande importância, temos a toxina citoletal distensora (do inglês cytolethal distending toxin, CDT), uma toxina bacteriana muito eficiente que provoca distensão celular e

morte devido ao bloqueio da divisão celular. Esta toxina é produzida por uma variedade de bactérias Gram-negativas, incluindo Campylobacter spp., Shigella spp., Escherichia coli e Haemophilus ducreyi (YOUNG; SCHAUER, 2000). As subunidades CDTA e CDTC são responsáveis pela ligação aos receptores de membrana em células sensíveis, funcionando, portanto, como portadores da subunidade CDTB, o componente tóxico nuclear que causa o rompimento de DNA dupla fita devido à sua atividade de DNase I (EC 3.1.21.1) (LARA- TEJERO; GALÁN, 2000, 2001; YOUNG; DAVIS; DIRITA, 2007), como esquematizado na Figura 4.

Figura 4: Representação da entrada de CDTB na célula humana.

Fonte: JINADASA et al., 2011.

As subunidades CDTA e CDTC da toxina citoletal distensora (CDT) ligam-se aos receptores nas áreas membranares ricas em colesterol, seguindo-se uma rápida endocitose da porção proteica ativa CDTB – com transporte retrógrado via Complexo de Golgi e retículo endoplasmático – e alcance do núcleo, para onde a CDTB é transportada ativamente, causando quebras no DNA de dupla fita.

O efeito final e visualizável da toxina é a alteração da estrutura do citoesqueleto em vários tipos celulares, distensão celular progressiva, bloqueio do ciclo celular na fase G2, e finalmente, a morte celular (GE; SCHAUER; FOX, 2008), como demonstrado no trabalho de Jinadasa et al. (2011), do qual foi extraída a Figura 5. A CDT, pela sua capacidade de causar apoptose, já foi testada como agente citotóxico para terapia antineoplásica (IWANAGA et al., 2007).

Figura 5: Efeito in vitro da incubação com CDT recombinante reconstituída (CjejCDT).

Fonte: JINADASA et al, 2011.

(a, b): Microscopia de luz, aumento de 60X, coloração hematoxilina-eosina. (a) Células HeLa incubadas com meio de cultura (DMEM) por 72 h (controle). (b) Células HeLa incubadas com DMEM contendo 25 g/mL de CjejCDT por 72 h (tratadas). Ocorreu aumento nuclear e citoplasmático das células tratadas quando comparadas com o controle. (c, d): Fotomicrografias de escaneamento por laser confocal, aumento de 40X, corantes Hoescht e iodeto de propídio. (c) Células MOLT-4 incubadas com meio de cultura (RPMI) por 24 h (controle). (d) Células MOLT-4 incubadas RPMI contendo 100ng/mL de CjejCDT por 24 h (tratadas). Mais de 85% das células tratadas apresentaram alterações apoptóticas – condensação e fragmentação da cromatina nuclear (azul) e captação citoplasmática de iodeto de propídio (rosa). Menos de 5% das células controle apresentaram morte celular (vermelho).

Alguns estudos foram capazes de correlacionar marcadores genéticos de C. jejuni com parâmetros clínicos apresentados pelos pacientes. Assim, foram determinadas a participação de: (i) LOS de membrana sializados na parede celular (HABIB et al., 2009; LOUWEN et al., 2008; MORTENSEN et al., 2009); (ii) flagelina O-glicosilada (CHAMPION et al., 2005); e (iii) marcadores metabólicos, como a enzima gama-glutamil-transpeptidase, enteroquelina de absorção (ceuE) e fosfolipase A (FEODOROFF et al., 2010; HOFREUTER; NOVIK; GÁLAN, 2008) na ocorrência de diarreia sanguinolenta e/ou diarreia de maior duração/gravidade dos sintomas, ou ainda na ocorrência de eventos autoimunes desencadeados pela infecção.