As análises bromatológicas foram feitas com o intuito de se conhecer a composição química das proteínas utilizadas em ambos os experimentos, caseína e PSL. Essas informações foram de extrema importância para a elaboração das dietas utilizadas nos experimentos. Foram avaliados os teores de umidade, conteúdo mineral total, teores de sódio e potássio, teor de gordura e de proteínas. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
4.4.1 Umidade
O método de secagem em estufa é baseado no princípio de que a amostra é aquecida sobre condições específicas e a perda de peso é usada para calcular o teor de umidade da amostra. É um dos métodos oficiais para determinação de umidade em alimentos (AOAC, 2000). Consiste em pesar uma quantidade de alimento (±5 g) em
um pesa-filtro previamente seco em estufa a 1050C e resfriado à temperatura
ambiente em um dessecador. A amostra é então levada em estufa a 1050C por 2-3
horas ou até peso constante. A diferença de peso é considerada o teor de umidade da amostra e é calculada segundo a fórmula:
𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈𝑈(%) =𝑃𝑃1−𝑃𝑃2𝑃𝑃1 𝑥𝑥100 (4)
sendo P1 o peso da amostra antes da secagem e P2 o peso da amostra seca.
4.4.2 Cinzas
O conteúdo de cinzas refere-se ao resíduo inorgânico remanescente da oxidação da matéria orgânica do alimento. Pode ser determinada via seca e via úmida. Cinza seca é obtido a partir da incineração da amostra em fornos (mufla) a
agentes oxidantes e é geralmente utilizada para a análise específica dos componentes das cinzas (NIELSEN, 2003).
A obtenção das cinzas por via seca é frequentemente utilizada para a determinação do conteúdo total de cinzas em alimentos, sendo o método de escolha da AOAC (2000). Consiste em pesar a amostra (±2 g) em um cadinho previamente incinerado e resfriado em um dessecador. Após a pesagem, realiza-se prévia incineração da amostra no bico de bunsen, finalizando-a na mufla, pelo período de 12 a 18 horas. Depois da completa incineração, os cadinhos são resfriados em dessecador e pesados. A diferença de peso é utilizada para o cálculo do teor de cinzas, calculado pela seguinte fórmula:
𝐶𝐶𝑈𝑈𝐶𝐶𝐶𝐶𝑈𝑈𝐶𝐶 𝐶𝐶𝑈𝑈𝑠𝑠𝑈𝑈𝐶𝐶(%) =𝑃𝑃1−𝑃𝑃2𝑃𝑃1 𝑥𝑥100 (5)
sendo P1 o peso da amostra antes da incineração e P2 o peso do resíduo inorgânico.
Para a análise dos componentes da cinza, utiliza-se a via úmida, que consiste
em aquecer a 2000C uma quantidade de amostra (±200 mg) dissolvida em 4 mL de
ácido nítrico. O aquecimento deve perdurar até que o desprendimento de gases amarelo e marrom cesse. Após isso, adiciona-se 1 mL de ácido perclórico e inicia-se novo aquecimento, que deve permanecer até a eliminação de fumaça branca, devido à evaporação dos ácidos utilizados, confirmando toda a eliminação da matéria orgânica. As amostras foram diluídas para 50 mL com água deionizada. Os teores de sódio e potássio foram determinados por fotometria de chama (AOAC, 2000).
4.4.3 Proteínas
O teor de proteínas foi determinado pelo método de Kjeldahl (AOAC, 2000), que consiste em digerir toda a matéria orgânica da amostra com ácido sulfúrico na
presença de catalisadores metálicos e altas temperaturas (200-3000C). O nitrogênio
que não foi digerido é convertido em sulfato de amônio, que será posteriormente neutralizado em NaOH 50% e destilado em solução de ácido bórico a 4%. O metaborato de amônio gerado é, então, titulado com cloreto de hidrogênio (HCl) 0,1
mol/L, quantificando-se, assim, o teor de nitrogênio da amostra por estequeometria. Utiliza-se para o cálculo do teor de proteínas um fator de conversão que, no caso de produtos lácteos, é de 6,38. Então, tem-se:
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑈𝑈í𝐶𝐶𝑈𝑈(%) = %𝐶𝐶𝑈𝑈𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑛𝑛ê𝐶𝐶𝑈𝑈𝑃𝑃 𝑥𝑥 6,38 (6)
4.4.4 Lipídeos
O teor de lipídeos foi determinado pelo método de Soxlet, que utiliza a extração com solventes orgânicos. É um método oficial de análise de alimentos (AOAC, 2000), em que o solvente orgânico separa a gordura da amostra por um processo semicontínuo de refluxo, que envolve volatilização e condensação do solvente. Após a extração, o solvente da mistura solvente + lipídeos é evaporada e se quantificam os lipídeos por pesagem.
4.5 Dosagens bioquímicas
4.5.1 Concentração de glutationa total em tecidos
A concentração de glutationa total foi mensurada utilizando-se o kit Sigma #CS0260. Este kit utiliza um método cinético para mensurar a concentração de glutationa total (GSH+GSSG) em amostras biológicas. (APENDICE A)
4.5.2 Catalase
A atividade da enzima catalase foi mensurada conforme descrito por Aebi (1984). (APÊNDICE A)
4.5.3 Proteína carbonilada
A determinação da concentração muscular e hepática de proteína carbonilada foi realizada conforme descrito por Levine et al. (1990). (APÊNDICE A)
4.5.4 Substâncias teativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Determinação da concentração de TBARS foi realizada conforme descrito por Buege e Aust (1978). (APÊNDICE A)
4.5.5 Proteínas totais em tecidos
O conteúdo de proteínas totais foi determinado pelo método de Lowry et al. (1951) (APÊNDICE A)
4.5.6 Glicogênio muscular
A concentração de glicogênio muscular foi determinado conforme descrito por Varnier et al. (1995). (APÊNDICE A)
4.5.7 Análise da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) 4.5.7.1 RNA total e cDNA
O ácido ribonucleico (RNA) total foi isolado a partir de 40-50 mg de amostras de músculo gastrocnêmio usando-se o método com tiocianato, homogeneizando as amostras com solução tampão de lise (Promega®, Estados Unidos - EUA). A quantidade final de RNA obtida foi mensurada espectrofotometricamente; 2 µg do RNA foram usados para sintetizar o cDNA, empregando kit comercial de transcriptase
reversa com primers randômicos (Applied Biosystems, EUA) em volume total de 20 µL, que foi posteriormente estocado a -80°C para posterior análise.
4.5.7.2 qPCR
A qPCR foi realizada utilizando-se o sistema de detecção ABI 7300 (Applied Biosystems, EUA), com o kit Power SYBR® Green PCR Master Mix (Biosystems, Foster City, CA). Os seguintes primers foram utilizados: mTOR (NM_019906) forward 5’- TCTTCTTCCAGCAAGTTCAGC-3’ e reverse 5’- GAATCAGACAGGCACGAAGG-3’ (97bp) , MAFbx (NM_133521) forward 5’- GCAAAACATAAGACTCATACG-3’ e reverse 5’-
GTAGAGTGGTCTCCATTCG-3’ (83bp), MuRF-1 (NM_080903) forward 5’-
AGGTGAAGGAGGAACTGAG-3’ e reverse 5’ AACTGCTCTCGGTACTGG-3’ (86 bp), conforme descrito por Drummond et al. (2008).
O gene GAPDH (AF106860) forward 5’- GGATGCAGGGATGATGTTCT-3’e reverse 5’- AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’ (116 bp) foi usado como controle endógeno para corrigir variações potenciais de RNA e DNA adicionadas à reação. Todas as reações foram realizadas em placas ópticas de 96 poços. Cada poço era preenchido com 1 µL do cDNA diluído, 6 µL do Power SYBR® Green PCR Master Mix, 0,48 µL do primer correspondente de cada gene e 4,52 µL de água DEPC, esterilizada, livre de ribonuclease (RNAase), gerando volume final de 12 µL em cada poço. Cada amostra foi analisada em triplicata. Um ciclo inicial de cinco minutos a 95°C foi usado para desnaturar o cDNA, seguido por 40 ciclos de 95°C por 20 segundos e um ciclo para anelamento dos primers de 55°C por 30 segundos. A quantificação relativa foi
realizada utilizando-se o método Ct comparativo - 2-ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001),
com os resultados expressos em diferenças percentuais em relação ao controle.