S ENSITIVITY A NALYSIS

As amostras de plasma, anteriormente congeladas a -20°C, foram submetidas à prova de inibição da hemaglutinação, utilizando-se hemácias de galinha e o vírus isolado no criadouro (Nogueira et al., 2001, 2002) como padrão e controle positivo. Esta prova foi realizada como um teste de inibição de hemaglutinação padrão, observando-se:

i) a utilização da solução de Alsever como anticoagulante do sangue de

galinha;

ii) a inativação do complemento das amostras;

iii) a adsorção prévia, às hemácias de galinha, de anticorpos inespecíficos

presentes nas amostras;

Tendo-se em vista as determinações microbiológicas, foram tomados todos os cuidados para que os procedimentos de colheita, inclusive na necropsia, não trouxessem qualquer prejuízo à representatividade das amostras. Todo o material não descartável utilizado foi cuidadosamente preparado seguindo-se protocolos de lavagem e esterilização. Após colhidas, as amostras foram mantidas sempre em gelo picado e processadas o mais rapidamente possível, objetivando-se a preservação dos microrganismos eventualmente presentes.

As amostras de traquéia e pulmão, provenientes dos animais que vinham a óbito, eram, em câmara de fluxo laminar, maceradas em PBS (1:10 v:v) e utilizadas nas determinações microbiológicas.

4.7.4 Pesquisa de Paramyxovirus

4.7.4.1 Isolamento em cultura de células VERO

As tentativas de isolamento do Paramyxovirus ofídico foram realizadas em culturas de células VERO provenientes do banco de células do Instituto Adolfo Lutz, SP (ATCC CCL-81). Como controle positivo, foi utilizado o vírus isolado no criadouro (Nogueira et al., 2001, 2002).

Inicialmente, as células eram cultivadas em garrafas de plástico (25 cm2) em Solução Essencial Mínima de Eagle suplementada com 10% de soro fetal bovino, as quais permaneciam por 48 horas a 37°C, quando a monocamada apresentava-se completa.

Para a inoculação dos lavados traqueopulmonares da primeira colheita, a uma alíquota de 250 µL do lavado foram acrescentados 730 µL de solução de Eagle mais 10 µL de anfotericina B (5 mg/mL) e 10 µL de gentamicina (40 mg/mL). Esta solução permanecia em temperatura ambiente por 10 minutos e era então colocada na garrafa

do cultivo celular (da qual havia sido retirado o meio de cultura com soro fetal sendo, em seguida, lavada apenas com o meio de cultura). A solução contendo a amostra era deixada em contato com o tapete celular por 30 minutos, sob agitação de 40 rpm. Decorrido este intervalo, acrescentava-se à garrafa mais 9 mL de solução de Eagle e incubava-se a 30°C, sob a mesma agitação, por 5 dias.

Devido a problemas com as culturas celulares, os lavados traqueopulmonares provenientes das segundas e terceiras colheitas, e os macerados de órgãos, não puderam ser inoculados no mesmo dia em que foram obtidas; assim, alíquotas destas amostras foram congeladas a -74°C até que pudessem ser processadas. Para inoculação destas amostras, passou-se a adicionar 250µL do material a 750µL de meio de cultura e então a filtrar este inóculo em filtro com porosidade de 0,45 µm, diretamente na garrafa da cultura celular, não mais utilizando os antimicrobianos, pois estes exerceram efeitos tóxicos sobre as culturas celulares. Estas garrafas permaneceram sob incubação por 10 dias, prazo mais adequado a evolução dos possíveis efeitos citopáticos.

Observando-se ou não efeitos citopáticos, após este tempo de incubação as garrafas inoculadas eram submetidas a congelação e descongelação por três vezes. Uma alíquota deste material era utilizada para a inoculação em uma segunda cultura celular, efetuando-se assim uma “passagem cega”.

4.7.4.2 Prova de hemaglutinação

Alíquotas da primeira e da segunda passagem das culturas celulares foram submetidas à reação de hemaglutinação com hemácias de galinha a 0,5%, tendo-se em vista que o Paramyxovirus ofídico apresenta atividade hemaglutinante.

4.7.4.3 Extração do RNA das amostras

Para a extração do RNA viral das amostras foi utilizado o seguinte protocolo:

i) adiciona-se 250 µL do lavado traqueopulmonar, do macerado de

pulmão, ou das culturas submetidas a congelação e descongelação por três vezes, a 750 µL de TRIZOL, e deixa-se esta solução em temperatura ambiente por, no mínimo, 10 minutos;

ii) acrescenta-se 200 µL de clorofórmio a cada amostra, homogeiniza-se,

e deixa-se em temperatura ambiente por mais 10 minutos;

iii) centrifuga-se a 4°C, a 12.000 x g, por 15 minutos; em seguida, é

retirado o sobrenadante, de aproximadamente 450 µL, onde estará o RNA, o qual é colocado em microtubos apoiados em gelo picado;

iv) a este sobrenadante são acrescentados 10 µg de glicogênio livre de RNAse e 500 µL de isopropanol, homogeniniza-se e deixa-se em temperatura ambiente por 15 minutos;

v) centrifuga-se nas mesmas condições anteriores e aspira-se a vácuo o

sobrenadante para que permaneça apenas o pellet de RNA no fundo do microtubo;

vi) este pellet será lavado pela adição de 1 mL de etanol a 75% em água

tratada com 0,1% de dietil pirocarbonato (DEPC) e centrifugação a 4°C, a 7.500 x g, por 5 minutos;

vii) aspira-se o sobrenadante, e deixa-se que o pellet seque à temperatura

ambiente por 10 minutos;

viii) ressuspende-se o pellet em 50 µL da água tratada com DEPC

contendo 0,1 U/µL de inibidor de RNAse e coloca-se esta suspensão em banho-maria a 56°C por 10 minutos para completa dissolução do RNA.

Após a diluição do material extraído a 1% em água ultrapura (MilliQ) autoclavada, o RNA era analisado espectrofotometricamente, em comprimento de onda de 260 e 280 nm, para determinação de sua concentração e pureza.

4.7.4.4 Obtenção do cDNA

Para obtenção do cDNA foi utilizada a enzima Superscript RT II (Gibco, BRL), conforme protocolo recomendado pelo fabricante, e como iniciador da reação de transcrição reversa foi utilizado o random

primer (hexâmeros ao acaso).

4.7.4.5 PCR e nested PCR

Para a realização do PCR e do nested PCR foi utilizada a metodologia proposta por Ahne et al. (1999), com algumas modificações. Utilizaram-se quatro primers (FDLV PCR sense: 5’-GCA GAG ATT TTC TCT TTC TT-3’; FDLV PCR antisense: 5’-AGC TCT CAT TTT GTA TGT CAT-3’; FDLV nested sense: 5’-TGA AGG CTG TTA CTG CTG C-3’ e FDLV nested antisense: 5’-CAT CTT GGC AAA TAA TCT GCC-3’) capazes de amplificar fragmentos de 627 (PCR) e 566 (nested) pares de bases (bp), do gene L (posições 9618 – 10244 e 9661 – 10226, respectivamente, de acordo com a seqüência da estirpe Sendai-Z, Genebank M30202).

Para amplificação do cDNA e do produto do PCR foram realizadas duas reações. Na primeira, utilizaram-se os oligonucleotídeos FDLV PCR antisense, FDLV PCR sense e o cDNA obtido a partir do RNA extraído das amostras e, na segunda, os oligonucleotídeos internos FDLV

nested antisense, FDLV nested sense e o produto da primeira reação.

Ambas foram realizadas em um volume final de 25 µL, contendo: 1,5 U de

Taq DNA Polimerase (Biotools), 75 mmol/L Tris HCl (pH 9,0), 2 mmol/L

MgCl2, 50 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH4)SO4, 5 ρmol de cada primer, 0,25

µL de dNTPs (20 mmol/L), 5 µL (PCR) ou 1 µL (nested PCR) da amostra e água ultrapura (MilliQ) autoclavada q.s.p.

A amplificação foi realizada em termociclador automático (MJResearch). Numa etapa inicial, as amostras foram incubadas a 94ºC por 3 minutos para as desnaturações, seguindo-se 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto para desnaturação da fita de DNA, 52ºC por 1 minuto para hibridação dos primers – sendo que, a cada ciclo, esta temperatura caia em 1ºC, chegando a 44ºC no nono ciclo, e permanecendo assim até o final -, e 72ºC por 1 minuto e 30 segundos, para extensão das fitas. Ao final, realizou-se uma incubação a 72ºC por 4 minutos, para garantir a presença dos DNAs amplificados em fitas duplas.

Os produtos obtidos na amplificação pela técnica de nested PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL) e examinados comparativamente com marcadores de peso molecular de 123 bp (Gibco-BRL), com auxílio de transiluminador UV, sendo considerados positivos aqueles com peso molecular aproximado de 627 bp para o PCR e 566 bp para o nested PCR.