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A técnica imuno-histoquímica veio facilitar o estudo do comportamento biológico do câncer através da utilização de anticorpos específicos para a detecção de antígenos associados a diversas funções celulares. Porém, a maioria dos trabalhos utiliza a comparação entre marcadores em cortes histológicos diferentes de um mesmo tumor, dificultando a sua comparação e correlação. Neste sentido, a realização da técnica de dupla marcação veio solucionar este problema, visto que sua principal vantagem é a possibilidade de análise direta entre os marcadores devido à co-localização dos mesmos. Desta forma o problema da heterogeneidade das neoplasias é superado, pois a dupla marcação assegura que as NORs sejam analisadas em um mesmo tipo celular desejado (RIVERO; AGUIAR, 2002).

Esta técnica consiste na marcação imuno-histoquímica de anticorpos combinada à técnica histoquímica do AgNOR em uma única preparação. Foi primeiramente descrita por McMeekin, Kennedy e McNicol (1989), que observaram uma redução na intensidade de marcação do anticorpo quando o AgNOR foi realizado antes da imuno-histoquímica, e quando esta era realizada primeiro houve um aumento da precipitação da prata. Quando o AgNOR foi incubado por um longo tempo houve um aumento da reação de fundo, o que dificultou a observação da marcação imuno-histoquímica.

Em relação ao tipo de material utilizado para a realização da técnica de dupla marcação, Murray et al. (1989) obtiveram bons resultados tanto com material congelado

quanto com material parafinado, demonstrado em tonsilas humanas. Para os dois tipos de secções a seqüência de realização do AgNOR, se antes ou depois da técnica imuno- histoquímica, não influiu nos resultados. Houve uma diferença de apenas 2 a 3% na contagem de NORs entre a técnica de dupla marcação e a técnica do AgNOR realizada isoladamente. Para uma perfeita definição das NORs, foi requerido um tempo mínimo de 60 minutos de incubação.

Janmohamed et al. (1990) estudaram, em material congelado, o número de NORs/núcleo de células Ki-67 positivas e negativas de 13 casos de linfoma não Hodgkin nodais através da técnica de dupla marcação. Um maior número médio de NORs/núcleo foi observado nas células Ki-67 positivas em comparação com as células Ki-67 negativas, tanto para lesões de alto quanto para lesões de baixo grau de malignidade, evidenciando uma forte associação entre a proliferação celular e o número de NORs em linfomas.

Através da dupla marcação PCNA/AgNOR em linfomas não-Hodgkin de alto grau e baixo grau de malignidade, Smith; Murray e Crocker (1993) observaram que, as células PCNA positivas apresentaram escores mais elevados para AgNOR que as células PCNA negativas, confirmando a associação das NORs com a proliferação celular. Além disso, tanto o número de células PCNA positivas quanto o número de NORs foram maiores em linfomas de alto grau de malignidade.

Para determinar o efeito da dupla marcação na imunorreatividade do Ki-67 e na reação do AgNOR, Munakata e Hendricks (1994) estudaram esta técnica em 8 tonsilas humanas emblocadas em parafina. Não foi observada nenhuma alteração na marcação para este anticorpo quando realizada a imuno-histoquímica isoladamente ou em conjunto com o AgNOR. Porém, quando analisados parâmetros morfológicos, tanto a média das áreas nucleares quanto a média das áreas das NORs apresentaram-se significantemente maiores na dupla marcação do que no AgNOR somente. Foi verificado que tal alteração era provocada pelo aquecimento do forno de microondas durante a recuperação antigênica.

O estímulo à proliferação celular provocou um aumento da contagem de NORs em células submetidas à técnica de dupla marcação PCNA/AgNOR num estudo com mucosa gástrica de ratos (GRAY et al., 1995). Tanto as células PCNA positivas quanto as PCNA negativas apresentaram este aumento. A contagem de NORs nas células PCNA positivas foi

maior que nas PCNA negativas nos dois grupos estudados, porém ambos os valores foram maiores para o grupo de ratos que receberam estímulo para a proliferação celular.

Costa et al., (1998) realizaram a otimização da técnica de dupla marcação em carcinoma epidermóide oral. Foi obtido resultado somente quando a imuno-histoquímica foi realizada antes da técnica do AgNOR, pois, do contrário, houve dissolução da prata durante o bloqueio da peroxidase endógena. Em relação ao agente cromógeno, os melhores resultados foram obtidos com o substrato cromogênico “new fuchsin” por 20 minutos. A utilização da “diaminobenzidina” não propiciou uma boa visualização e individualização das NORs pela semelhança desta coloração com a coloração do AgNOR. A incubação do AgNOR durou 35 minutos em estufa a 45°C livre da luz. Acima desta temperatura ocorreu precipitação da prata. Costa et al (1999) concluíram, em um estudo com dupla marcação PCNA/AgNOR e Ki-67/AgNOR em carcinoma epidermóide oral, que a média de NORs/núcleo correlaciona-se intimamente com a proliferação celular. Esta média foi significativamente maior nas células marcadas pelos anticorpos contra os marcadores de proliferação celulares Ki-67 e PCNA, quando comparada à média das células não marcadas (p=0.00000 e p=0.0004, respectivamente).

Rivero e Aguiar (2002) realizaram a dupla marcação em carcinoma adenóide cístico e também obtiveram melhores resultados quando o AgNOR foi realizado posteriormente a imuno-histoquímica, permitindo melhor visualização das NORs e melhor definição da imunopositividade para o PCNA. O tempo de incubação da prata foi de 25 minutos em temperatura ambiente. Os autores obtiveram menos coloração de fundo com a utilização do forno de microondas. Não foi observada diferença estatisticamente significante no número médio de NORs/núcleo de células PCNA positivas e negativas apesar da diferença na média total (2.14 para as positivas e 1.97 para as negativas).

3 PROPOSIÇÃO

Este trabalho se propôs pesquisar a expressão imuno-histoquímica da p53 e o número médio de NORs/núcleo entre células p53 positivas e negativas, como também a correlação do número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas e negativas com os escores