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Foram analisadas, ainda, possíveis correlações entre as imunoexpressões da IL-17 com a IL-23. Nas lesões de LPO, o teste de correlação de Spearman demonstrou não haver correlação estatisticamente significativa entre as marcações de IL-17 e IL-23 (r = 0,054; p = 0,738). Resultados similares foram obtidos após análise isolada em lesões de LPO reticular (r = 0,054; p = 0,805) e erosivo (r = 0,170; p = 0,499). Para o grupo das HFIs, foi constatada uma tendência de moderada correlação positiva entre as imunoexpressões de IL-17 e IL-23 (r = 0,620; p = 0,056).

Figura 2. Fotomicrografias de espécimes de LPO

exibindo: A) hiperparaceratinização (HE, 100x); B) epitélio de revestimento atrófico (HE, 200x) e; C) projeções epiteliais hiperplásicas (HE, 40x).

A

B

Figura 3. Fotomicrografia demonstrando corpos apoptóticos (corpos de Civatte)

em lesão de LPO (HE, 400x).

Figura 4. Fotomicrografia exibindo formação de centros germinativos em lesão de

Figura 5. Fotomicrografia exibindo a imunoexpressão da IL-17 no infiltrado

inflamatório de LPO. Linfócitos imunopositivos (setas) (LSAB, x400).

Figura 6. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da IL-17 em LPO,

destacando-se a imunomarcação das células epiteliais (LSAB, x400).

Figura 7. Fotomicrografia revelando células endoteliais (setas pretas) e macrófagos

(setas brancas) exibindo imunopositividade para a IL-17 (LSAB, x400).

Figura 8. Fotomicrografia exibindo imunoexpressão da IL-17 no infiltrado

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da IL-23 no

infiltrado inflamatório de espécime de HFI (LSAB, x400).

Figura 10. Fotomicrografia exibindo a imunoexpressão da IL-23 no infiltrado

inflamatório e em algumas células epiteliais de espécime de LPO. Destacam-se os linfócitos imunomarcados (setas) e ainda, uma marcação pericelular (LSAB, x400).

Figura 11. Fotomicrografia revelando imunoexpressão da IL-23 em infiltrado

inflamatório em espécime de LPO. Macrófagos (setas pretas) e células endoteliais (setas brancas) imunomarcados (LSAB, x400).

6 DISCUSSÃO

O líquen plano oral é uma doença inflamatória crônica e imunomediada (AL- HASHIMI et al., 2007; CARBONE et al., 2009), na qual são reconhecidas seis formas clínicas: reticular, papular, placa, atrófica, bolhosa e erosiva (EDWARDS; KELSCH, 2002; NICO; FERNANDES; LOURENÇO, 2011). No entanto, a maioria dos autores consideram apenas duas formas principais de apresentação clínica da doença: a reticular e a forma atrófico/erosiva, sendo esta a divisão utilizada em muitos estudos (KARATSAIDIS et al., 2003; SEOANE et al., 2004; LUKAČ et al., 2006; BRANT; VASCONCELOS; RODRIGUES, 2008; CHARAZINSKA-CAREWICZ et al. 2008; LÓPEZ-JORNET, CAMACHO-ALONSO e MOLINA-MIÑANO 2009).

Esta classificação foi utilizada no presente estudo, principalmente pelo comportamento biológico diferente que estas duas formas clínicas apresentam, que ressalta a importância de estudá-las separadamente. Quanto a isto, alguns autores ainda sugerem que as formas clínicas reticular e erosiva do LPO devem ser consideradas entidades distintas (KARATSAIDIS et al., 2003; XIA et al., 2006; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009; FERNÁNDEZ -GONZÁLEZ et al., 2011).

Os achados histopatológicos epiteliais das lesões de LPO incluem: hiperceratose, ausência de displasia, presença de projeções em dentes de serra, sinais de degeneração da camada basal, presença de ceratinócitos apoptóticos, além de ocasional acantose e hiperplasia. Em região justepitelial, a lesão é caracterizada por denso infiltrado inflamatório linfocícito e em alguns casos, por fendas de Max-Joseph (SOUSA et al., 2009; ANURADHA et al., 2011; FERNÁNDEZ-GONZALEZ et al., 2011; NAVAS-ALFARO et al., 2011).

No que concerne à ceratinização epitelial nas lesões de LPO, no presente estudo a maioria dos casos exibiu hiperceratinização, sendo este achado mais comum nas lesões reticulares (91.3%), o que corrobora o estudo de Fernández-González et al. (2011). Além disto, com relação ao tipo de ceratinização epitelial, neste estudo a maior parte das lesões exibiu hiperparaceratinização, o que também foi encontrado nos trabalhos de Navas-Alfaro et al. (2003) e López-Jornet; Camacho-Alonso; Molina-Miñano (2009). Para Edwards e Kelsch (2002) as áreas focais de epitélio hiperceratinizado dão origem às clinicamente aparentes estrias de Wickham. De acordo com Neville et al. (2009) graus variáveis de ceratinização podem estar presentes na superfície do epitélio, dependendo se o espécime foi obtido de uma lesão reticular ou erosiva. No entanto, o presente estudo demonstrou não haver associação

estatisticamente significativa entre as características de ceratinização epitelial e o tipo clínico de LPO (p = 0,377).

Neste estudo, os espécimes de LPO erosivo demonstraram maior atrofia epitelial quando comparados às lesões de LPO reticular (p=0,011). No trabalho de Brant, Vasconcelos e Rodrigues (2008), de forma geral, as lesões de LPO exibiram espessura epitelial reduzida e os autores também encontraram que as lesões da forma clínica erosiva apresentaram uma significativa maior atrofia epitelial quando comparadas às lesões reticulares, achado este que também foi semelhante ao de Karatsaidis et al. (2003). A hiperplasia epitelial foi encontrada em 65% das lesões reticulares e em 22,2% das erosivas da presente amostra, o que se assemelhou aos resultados encontrados por Fernández-González et al. (2011), que foram de 85,19% e 14,21%, respectivamente. Além disto, os autores supracitados encontraram evidências de erosão epitelial em seis amostras, das quais cinco pertenciam ao grupo atrófico/erosivo.

Na presente amostra, grandes quantidades de corpos apoptóticos foram encontradas tanto nas lesões de LPO reticular, quanto de LPO erosivo, correspondendo a 95,6% e 83,3%, respectivamente. Este achado foi semelhante ao do trabalho de Fernandez-Gonzalez et al. (2011), onde em 92% das lesões de líquen plano reticular e 90,9% das lesões atrófico/erosivas foram encontrados corpos de Civatte. Brant, Vasconcelos e Rodrigues (2008) encontraram evidências histormorfológicas de ceratinócitos apoptóticos em toda a amostra avaliada e segundo estes autores, a apoptose ocorre apenas na camada basal e parabasal das lesões de LPO devido à maior susceptibilidade ao dano causado pelo infiltrado inflamatório subjacente. Já no estudo de López-Jornet, Camacho-Alonso e Molina-Miñano (2009) este achado histomorfológico foi encontrado em 35% das lesões estudadas, enquanto no estudo de Sousa et al. (2009), corpos apoptóticos foram observados em apenas 3,57% dos casos. As discrepâncias nestes achados provavelmente refletem diferentes avaliações baseadas em critérios distintos para se considerar a presença de corpos de Civatte.

Lage et al. (2011) encontraram níveis significativamente elevados de células epiteliais imunopositivas para moléculas citotóxicas associadas com a apoptose como a Granzima-B e a perforina no LPO quando comparado ao LP cutâneo. Além disto, também encontraram níveis significativamente maiores de corpos apoptóticos nas lesões de LPO. Para os autores, esta diferença pode residir no fato de que a mucosa oral, quando comparada à pele, está exposta a maior quantidade de antígenos, sejam eles oriundos dos alimentos ou de bactérias, fungos e vírus. É possível que esta grande carga antigênica interfira nas células imunocompetentes da mucosa oral, o que também poderia explicar, em parte, a observação clínica de que, enquanto

as lesões de pele são auto-limitadas e possuem apenas o prurido como o principal desconforto, o LPO possui natureza crônica, as lesões podem permanecer por anos e com períodos de alternância entre a exarcebação e a quiescência, e ainda, serem dolorosas nas áreas ulceradas e eritematosas.

O estudo de Brant, Vasconcelos e Rodrigues (2008) buscou avaliar a quantidade de apoptose comparando o LPO reticular e erosivo com espécimes de mucosa oral saudável através da técnica TUNEL, que detecta a fragmentação genômica in situ e confirma a apoptose. A apoptose nas células epiteliais foi menos intensa no grupo controle do que no grupo de LPO reticular, que apresentou níveis significativamente menores de apoptose do que o grupo de LPO erosivo. Já a espessura epitelial no grupo controle foi significativamente maior do que nas lesões de LPO reticular, que por sua vez, exibiu significativa maior espessura do que as lesões erosivas. Além disto, uma forte correlação negativa entre os índices de espessura epitelial e os índices de apoptose foi encontrada. Para estes autores, o achado da atrofia epitelial nos casos de LPO está fortemente associado ao fato do epitélio estar sob constante apoptose e é mais fortemente encontrado em lesões de LPO erosivo porque esta forma clínica seria mais agressiva. No entanto, no presente estudo não se encontrou diferenças estatisticamente significativas na análise da presença de corpos apoptóticos com a forma clínica da lesão (p = 0,303).

Na amostra avaliada, aproximadamente metade dos casos de LPO exibiu a presença de projeções epiteliais, porém em poucos espécimes foram encontradas as projeções em dentes de serra, enquanto Fernández-González et al. (2011) encontraram a presença destas projeções em 30% da amostra avaliada. Para Navas-Alfaro et al. (2003) o aspecto clássico em dentes de serra é resultante da associação de acantose com a dilapidação da região interpapilar provocada pela ação corrosiva do infiltrado inflamatório sobre o epitélio. Sousa et al. (2009) não encontraram este achado morfológico em seu estudo, embora tenham considerado que existiam projeções epiteliais alteradas em 89,29% dos casos avaliados.

Dentre os critérios para diagnóstico histopatológico definidos pela OMS em 1978 e modificados por van der Meij e van der Waal (2003), as lesões de LPO devem exibir a presença de infiltrado inflamatório bem-definido, disposto em faixa, confinado à parte superficial do tecido conjuntivo e constituído em sua maior parte por linfócitos. Corroborando os critérios diagnósticos, no presente estudo, toda a amostra de LPO exibiu intenso infiltrado inflamatório e disposto em faixa em região justaepitelial, semelhante aos resultados encontrados por Brant, Vasconcelos e Rodrigues (2008), Sousa et al. (2009), Anuradha et al. (2011) e Fernández-González et al. (2011). No entanto, alguns autores buscaram classificar a

densidade do infiltrado inflamatório encontrado nas lesões: no trabalho de Seoane et al. (2004), 31% dos casos demonstraram infiltrado inflamatório subepitelial leve, 37,9% foram considerados como moderado e em 31% dos casos, severo. Já López-Jornet, Camacho-Alonso e Molina-Miñano (2009) encontraram que em 28% dos casos de LPO avaliados, o infiltrado inflamatório subepitelial foi considerado leve, moderado em 33% dos casos e severo em 39% das lesões. Ambos os estudos concluíram que a severidade do infiltrado inflamatório foi independente da forma clínica de apresentação da doença, e que a agressividade das lesões bem como a evolução na direção da forma clínica atrófico-erosiva, não dependeriam da quantidade de infiltrado inflamatório nas lesões.

Centros germinativos são microambientes especializados que se coram fracamente dentro de folículos linfóides do baço, de linfonodos ou de tecidos linfóides da mucosa e se formam na fase tardia das respostas imunes humorais dependentes de linfócitos T contra antígenos específicos, sendo este o local de maturação por afinidade, geração das células B de memória e troca de isótipo destes linfócitos (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008). Embora tenha sido sugerido um papel da imunidade humoral nas lesões de LPO (LUKAČ et al., 2006), a resposta imune celular na lesão é principalmente de linfócitos T (LODI et al., 2005; SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010) e além disto, poucos linfócitos B ou plasmócitos e depósitos mínimos de imunoglobulinas podem ser encontrados no infiltrado inflamatório característico da lesão (SUGERMAN et al., 2002). Este fato poderia ser uma possível explicação para o número reduzido de amostras exibindo formação de centros germinativos (2 casos) encontrados neste estudo.

Segundo Shaker e Saad (2011), a patogenia do LP está associada a uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia na qual há liberação de citocinas pelos linfócitos T ativados, que por sua vez levam ao recrutamento de mais células inflamatórias e a subsequente destruição dos ceratinócitos por meio de citotoxicidade mediada por células TCD8+. No entanto, a grande quantidade de linfócitos T no infiltrado inflamatório das lesões de LP apóia a participação da imunidade celular com ambos os linfócitos TCD8+ citotóxicos e TCD4+ auxiliares desempenhando um papel vital na patogênese desta desordem.

As células TCD4+ auxiliares são importantes mediadoras das respostas imunes adaptativas e, interagindo com as APCs, recebem sinais pelo engajamento do TCR (sinal 1), pelas moléculas co-estimuladoras (sinal 2) e por uma complexa rede de sinalização por citocinas (sinal 3). Subsequentemente, passam por diferenciação e ativação em células TCD4+ efetoras, atuando na defesa do hospedeiro contra antígenos estranhos (KHADER; GAFFEN; KOLLS, 2009).

Dois subtipos de células TCD4+ auxiliares foram caracterizados de acordo com as citocinas produzidas e com seus fatores de transcrição. As células Th1, que são consideradas mediadoras da imunidade celular, possuem o T-bet como fator de transcrição e produzem principalmente o INF-γ e IL-2. Em contraste, as células Th2 se diferenciam na presença do fator de transcrição GATA-3 e produzem principalmente a IL-4, IL-5 e a IL-13. Outra linhagem de células TCD4+ que complementa o paradigma Th1/Th2 e se desenvolve frente a fatores distintos dos que são necessários para induzir respostas Th1 ou Th2 são as células Tregs. Esta subpopulação exibe o fator de transcrição FoxP3 e possui atividade imunossupressora (PECK; MELLINS, 2009).

No entanto, a descoberta de um novo subtipo de células TCD4+ auxiliares, as células Th17, provocou o colapso do paradigma Th1/Th2/Treg que permaneceu aceito por muito tempo. A linhagem Th17 é, atualmente, amplamente aceita como uma linhagem distinta de células TCD4+ que são responsáveis pela produção de IL-17 e que possuem a diferenciação induzida pelo fator de transcrição RORγt. O papel das células Th17 vem sendo investigado em vários setores, incluindo a inflamação, a infecção e a autoimunidade (NOGRALES et al., 2008). A descoberta desta nova linhagem preenche algumas lacunas que existiam na imunidade do hospedeiro e que não eram inteiramente explicadas pelo paradigma Th1/Th2 (KHADER; GAFFEN; KOLLS, 2009; PECK; MELLINS, 2009).

Além da forte implicação das células Th17 com a autoimunidade, existem evidências do papel crítico da citocina de assinatura da linhagem, a IL-17, na proteção contra infecções tanto através do recrutamento de células protetoras, como pela indução de agentes antimicrobianos durante o início da resposta imunológica nas mucosas. No entanto, a resposta Th17 nestas situações, em alguns casos pode ser contraditória e o curso da infecção vai ser definido pelo equilíbrio entre a proteção e a doença (KHADER; GAFFEN; KOLLS, 2009).

Adicionalmente ao fator de transcrição da linhagem, a diferenciação das células Th17 é determinada por uma extensa rede de citocinas como a IL-6, o TGF-β, a IL-21 e a IL-23. Acredita-se que a IL-23 estabiliza o comprometimento com esta linhagem (KORN et al., 2009), promovendo a propagação da mesma (STRZEPA; SZCZEPANIK, 2011). Já a IL-6 teria o papel de direcionar a sinalização do STAT-3 que é necessário para a função do RORγt, que por sua vez controlaria a expressão de receptores para a IL-23 aumentando a responsividade destas células a tal citocina, o que mantém as respostas específicas da linhagem (IVANOV et al., 2006; YANG et al., 2008; COSTA; MATTANA; SILVA, 2010). Tendo em vista o importante papel das citocinas IL-17 e IL-23 para a resposta do tipo Th17, estas citocinas foram escolhidas para a avaliação desta resposta no LPO neste estudo.

Apesar da patogenia do LPO estar cada vez mais estabelecida, a etiologia permanece pouco esclarecida, uma vez que o antígeno que desencadeia esta desordem ainda permanece desconhecido. Porém, evidências clínicas e muitos estudos têm demonstrado a possibilidade do LPO ser uma doença autoimune. Em relação à participação das células TCD4+ na patogenia da lesão, os achados são conflitantes: nos estudos de Khan et al. (2003) e Lu et al. (2011), os autores afirmaram que há o desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1, enquanto Liu et al. (2009) encontraram a predominância de uma resposta do tipo Th2, já Rhodus, Cheng e Ondreyz (2007) concluíram que diferentes padrões de desequilíbrio entre as linhagens Th1 e Th2 podem ocorrer na patogenia do LP, enquanto Kalogerakou et al. (2008) afirmaram que tanto a produção de citocinas associadas à resposta Th1 quanto à Th2 estão diminuídas nos pacientes afetados pelo LPO. Destaca-se, portanto, a importância de investigar o possível papel das citocinas associadas com a linhagem Th17, fortemente implicadas na patogenia de doenças autoimunes, LPO.

A escolha da HFI para comparação das imunoexpressões da IL-17 e da IL-23 com o LPO foi baseada no fato que espécimes de ambas as lesões podem se assemelhar histologicamente, uma vez que são lesões de mucosa oral que podem exibir intenso infiltrado inflamatório justaepitelial, mas que exibem patogenias completamente distintas. É importante destacar, ainda, que todas as lesões de HFI selecionadas para este estudo exibiam intenso infiltrado inflamatório subepitelial. Embora a diferença entre a quantidade de linfócitos imunopositivos para a IL-17 entre o grupo do LPO e da HFI não tenha sido estatisticamente significativa, um maior número foi encontrado no grupo do LPO. Adicionalmente, foi encontrada forte imunomarcação nas células epiteliais no grupo do LPO, o que não foi observado no grupo da HFI. Na literatura tem sido relatado que, dentre outros eventos, ciclos inflamatórios viciosos podem recrutar células Th17 e que a IL-17 pode agir como um potente mediador pró-inflamatório (KOLLS; LINDEN, 2004; COOKE, 2006; WEAVER et al., 2007; KORN et al., 2009). Além disto, o desenvolvimento de desordens inflamatórias nas superfícies mucosas pode estar associado à presença da IL-17 (MUCIDA; SALEK- ARDAKANI, 2009). Em conjunto, estes relatos poderiam justificar, em parte, a presença da IL-17 nas lesões de HFI que foi encontrada no presente estudo.

Em termos funcionais, a IL-17 atua sobre diversas células além dos linfócitos, entre estas: células endoteliais, fibroblastos, ceratinócitos e macrófagos (DAMSKER; HANSEN; CASPI, 2010) e para Martinez et al. (2008), a participação da IL-17 nas doenças autoimunes e inflamatórias estaria baseada na capacidade que esta citocina possui em induzir a produção de quimiocinas, metaloproteinases da matriz e peptídeos antimicrobianos nos tecidos

circunjacentes, levando à inflamação através do recrutamento de neutrófilos e macrófagos . Além disto, foi demonstrado que as células Th17 apresentam pouca susceptibilidade à tolerância induzida por alguns tipos de células Tregs e esta linhagem se mostrou, em alguns estudos, incapaz de inibir a produção da IL-17 (ANNUNZIATO et al., 2007; EVANS et al., 2007; FLETCHER et al., 2009), sendo este um possível mecanismo adicional que explicaria a importante associação da linhagem Th17 com a autoimunidade.

Neste sentido, o primeiro estudo que sugere um possível papel da IL-17 na patogênese do LP cutâneo dá suporte à idéia de que a resposta Th17 pode estar associada com a patogenia desta desordem, pois foram encontrados, através da técnica ELISA, níveis significaticamente mais altos de IL-17 no sangue periférico de pacientes com LP cutâneo quando comparados com controles saudáveis. Para os autores, a participação da IL-17 na patogenia da lesão pode estar associada com a potencialização das reações mediadas pelos linfócitos T, pela indução de quimiocinas e através de indução da produção de outras citocinas. Além disto, outros mecanismos como a degranulação de mastócitos e a ativação de MMPs também têm sido associados com a patogenia desta desordem e a IL-17 tem sido implicada com a regulação positiva e com o sinergismo com mediadores de inflamação local, além de promover danos à matriz extracelular através da produção de MMPs (SHAKER; SAAD, 2011). Além dos danos à matriz extracelular, de acordo com Mazarella et al. (2006), as MMPs seriam responsáveis pela degradação da membrana basal epitelial que é característica nas lesões de LP, residindo aí um dos possíveis mecanismos de dano tecidual induzido pela IL-17 nas lesões de LPO. Todo este mecanismo também poderia explicar a participação da IL-17 na patogenia do LPO, uma vez que no presente estudo, a presença desta citocina estava elevada, embora em quantidades não estatisticamente significativas quando comparadas às HFIs.

Para Steinman (2007) a resposta Th17 pode ser induzida em um estágio precoce no desenvolvimento das doenças e a subsequente liberação de IL-17 pode aumentar a expressão de moléculas de adesão vascular, que por sua vez, aumentaria a migração de linfócitos intravasculares para os sítios de inflamação, permitindo que as células Th17 obtenham acesso ao tecidos lesados e iniciem a secreção de citocinas associadas à linhagem, que atuariam exarcebando a doença. Embora de difícil comprovação, poderia haver uma participação da IL- 17 em um estágio precoce das lesões de LPO, já que no início das lesões há intensa migração de linfócitos T do meio intravascular para o local onde há a expressão do antígeno desconhecido (LODI et al., 2005; ROOPASHREE et al., 2010). Neste sentido, Nguyen et al. (2008) encontraram níveis séricos e salivares elevados de IL-17 em camundongos em

períodos ligeiramente anteriores à manifestação clínica da síndrome de Sjögren, indicando que nesta doença, a participação da IL-17 na patogenia da lesão ocorre em estágios precoces.

Na patogenia do lúpus eritematoso sistêmico, Crispín e Tsokos (2010) afirmaram que altos níveis de IL-17 provavelmente contribuem para o recrutamento e a ativação de células do sistema imune, como por exemplo, neutrófilos e linfócitos T para os órgãos-alvo nesta doença, amplificando a subsequente resposta imune. Para Yap e Lai (2010) as citocinas