Reliability and Validity

RESISTÊNCIA BACTERIANA

A proteômica, em sua essência, é a caracterização de um conjunto de proteínas de um organismo, tecido ou célula, em um determinado momento e em uma determinada situação (PERSIDIS, 1998). Quando associada às técnicas de eletroforese bidimensional (2-DE) (GORG et al., 1988) e espectrometria de massa, tendo como apoio bancos de dados de proteínas, a proteômica é capaz de resolver com acurácia e reprodutibilidade muitas proteínas e peptídeos de um extrato celular total. Uma resolução ainda maior é obtida quando esses extratos são resultantes de subproteomas, como um tecido específico ou mesmo compartimentalização celular. Estas fe rramentas proteômicas têm sido usadas com sucesso na resolução de proteomas completos de microrganismo s, gerando bancos de dados de géis e proteínas, grande parte destes disponíveis online (GASTEIGER et al., 2003; HOOGLAND et al., 2008). Esse é o caso de E. coli, que além de ter completa a notação de sua sequência genômica (PERNA et al., 2001), também possui um banco de dados de análises de géis 2-DE (VIJAYENDRAN et al., 2007) e uma série de estudos do seu perfil proteico (HAN, LEE, 2006), auxiliando

inclusive no entendimento de seu processo evolutivo (PELOSI et al., 2006; MADDALO et al., 2011). Neste âmbito, os subproteomas bacterianos também têm sido amplamente estudados (XIA et al., 2007), com ênfase à parede celular (SCHAUMBURG et al., 2004), à membrana externa (MARANI et al., 2006; ALTERI, MOBLEY, 2007), à membrana interna (DALEY et al., 2005; BAARS et al., 2008) e ao secretoma (HIROSE et al., 2000; CHEN, S., WILSON, 2007).

As ferramentas proteômicas têm sido frequentemente aplicadas em estudos sobre resistência bacteriana, principalmente envolvendo mecanismos de resistência aos antibióticos clássicos , na busca de possíveis novos alvos para agentes antimicrobianos e, assim, uma estratégia experimental no tratamento de infecções (PENG et al., 2005; XU et al., 2006; RONCADA et al., 2009; GAUTAM et al., 2011). Gautam e colaboradores (2011), por exemplo, identificaram oito proteínas diferencialmente expressas em extrato total de E. coli multirresistente a antibióticos como possíveis alvos, supostamente envolvidas com a propriedade de resistência antibiótica. As proteínas identificadas nesse trabalho são porinas de membrana (TolC, OmpA, OmpC, e precursor de Nmpc), proteínas envolvidas na síntese proteica microbiana (EF-Ts, EF-Tu e RpsA) e Dps, uma proteína de localização e função desconhecidas. Adicionalmente, por análise proteômica comparativa in-gel, Soualhine et al. (2005) identificou uma nova função para a proteína PstS, subunidade de um transportador de fosfato tipo ABC, em S. pneumoniae resistente a penicilina. A superexpressão de PstS apresentou excelente correlação com a perda da susceptibilidade ao antibiótico.

Por sua vez, estudos proteômicos cujos subproteomas são explorados individualmente têm resultado em uma resolução ainda maior das proteínas e modificações metabólicas que formam barreiras à ação dos antibióticos. Pode ser citada, a identificação, por análises proteômicas in-gel, de proteínas de membrana externa (OMPs) de E. coli K-12 associadas a resistência a tetraciclina e ampicilina (XU et al., 2006), dentre as quais três já eram reconhecidas como proteínas de resistência a antibióticos ( TolC, OmpC e YhiU), enquanto que LamB, Tsx, YfiO, OmpW, NlpB e o precursor FimD foram pela primeira vez relacionadas a estes processos. Posteriormente, Lin et

al. (2008), associando técnicas de biologia molecular e proteômica, também observaram a regulação positiva na expressão das OMPs TolC, OmpC e também das porinas OmpT e OmpW em membrana externa de E. coli resistente a ácido nalidíxico. Semelhantemente, a superexpressão da porina OmpD foi descrita em Salmonella enterica serovar Typhimurium resistente a ceftriaxona, onde também foi observada a redução na expressão de uma subunidade da oxidorredutase NuoB, bombeadora de prótons (HU et al., 2007). Ainda, através de análises proteômicas in-gel, uma variedade de porinas em membrana externa tem sido associada à resistência de P. aeruginosa a ampicilina, canamicina e tetraciclina (PENG et al., 2005), bem como à resistência de E. coli K-12 a cloreto de benzalcônio (BORE et al., 2007).

Análises no subproteoma citosólico , pelo método de eletroforese bidimensional com marcação por fluorescência (2D-DIGE), permitiram também a identificação de proteínas associadas à resistência de E. coli a piperacilina/tazobactam, indicando pela primeira vez a associação do sistema de bombas de efluxo com a resistência a piperacilina/tazobactam (DOS SANTOS, K.V. et al., 2010b). Contudo, alterações globais neste subproteoma puderam ser observadas ao comparar isolados de E. coli resistentes a piperacilina/tazobactam com isolados não resistentes, resultado da regulação positiva na expressão de 12 proteínas relacionadas à virulência bacteriana, proteção de DNA durante estresse e mesmo a resistência a antibióticos ; bem como a regulação negativa em 14 proteínas envolvidas na glicólise, síntese proteica, via das pentoses-fosfato, transporte de aminoácidos, divisão celular e estresse oxidativo. Ainda, análises por 2-DE clássico associado a MS/MS do secretoma e proteínas citosólicas de S. aureus resistentes meticilina, isolados

em humanos e bovinos, sugeriram o envolvimento de -lactamases adicionais

além da penicilinase BlaZ, associadas a resistência limítrofe ao antibiótico (KESERU et al., 2011).

A maioria dos estudos proteômicos em resistência a AMPs foram concentrados em bactérias Gram-positivas (SCHERL et al., 2006; THEDIECK et al., 2006; DRUMMELSMITH et al., 2007), em detrimento dos poucos trabalhos dos dedicados a resistência em bactérias Gram -negativas. Dentre estes, o único estudo proteômico em membranas externa e interna, realizado

em Vibrio parahaemolyticus por proteômica in-gel, (SHEN et al., 2010), mostrou que a resistência a AMP pode resultar de múltiplos mecanismos moleculares, como 1) efluxo de AMP mediado pela superexpressão de TolC e F1-ATPa, multitransportadores de medicamentos por efluxo depen dentes de energia; 2) reparo das membranas danificadas pelos AMPs, através do aumento da biossíntese de fosfolipídios com a superexpressão da diidrolipoamida desidrogenase; 3) prevenção da penetração celular dos AMPs através regulação negativa de FadL, transportador ligado à membrana externa que interage hidrofobicamente com os AMPs.

Com uma frequência cada vez maior, a proteômica tem sido identificada como ferramenta primordial para o estudo e compreensão da relação entre genótipos e fenótipos (RABILLOUD, 2002; RABILLOUD et al., 2002; LEVERT et al., 2010). As proteínas expressas por um determinado organismo, em um determinado momento, estão diretamente relacionadas à resposta do organismo ao ambiente ao qual está exposto (BARDEL et al., 2002; KANEKO, FURUSAWA, 2008). Tal conceito aplica-se também à ocorrência de resistência da bactéria a antibióticos, cuja origem é fundamentada na genética bacteriana. Em suma, a elucidação do mecanismo molecular responsável pela resistência a CAMPs está longe de completa, especialmente em relação à resistência de bactérias Gram -negativas. Aparentemente, é necessária uma rede complexa envolvendo inúmeras modificações estruturais e fisiológicas na célula, se não a remodelagem do metabolismo completo, para alcançar a condição de resistência. A abordagem proteômica permite uma visão completa da expressão proteica e foi usada neste trabalho em busca de um amplo panorama do metabolismo de E. coli quando induzido a resistência a magainina I.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.7 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE SEMENTES DE GERGELIM