Games Are Important

Uma alíquota do filtrado da cultura foi incubada a 45° e 50°C e a atividade proteolítica residual quantificada nos intervalos de tempo de pré-incubação de: 0’,15’,30’, 45’, 60’,12’,180’, 240’ e 300 minutos. A atividade proteolítica residual foi quantificada conforme procedimento descrito no item 4.5.1.

5. RESULTADOS

Foi detectada atividade proteolítica nos filtrados das culturas dos 15 isolados de Trichoderma, quando cultivados em meio de cultura contendo o micélio de F. oxysporum como única fonte de carbono. Valores de atividade proteolítica mais significativos na faixa de pH neutro e alcalino (pH 7,0 e pH 8,0), foram obtidos para os isolados ALL 05, 08, 16, 18, 28, 42, 43, 47 e 49, não sendo detectada apenas para o isolado ALL-21 (Figura 2). Atividade proteolítica alcalina significativa foi obtida para os filtrados das culturas dos isolados ALL 05, 28 e 49, destacando-se os valores detectados para os dois últimos (Figura 2C). Os valores de atividade proteolítica no pH ácido foram inferiores aos obtidos para os pH´s neutro e alcalino, (Figura 2B e 2C). Dentre os isolados que apresentaram os valores mais significativos de atividade proteolítica em pH ácido, destacam-se: Tc, ALL 05, 08, 24, 28 e 49. (Figura 2A).

Figura 2. Atividade proteolítica expressa em U/mL dos filtrados das culturas dos isolados de T.

harzianum cultivados em meio mínimo por 48 horas contendo o micélio de F. oxysporum como fonte

de carbono. O ensaio de atividade proteolítica foi realizado utilizando azocaseína como substrato e nos pH’s 4 (A), 6 (B) e 8 (C). Os valores de desvio padrão foram inferiores a 10%.

(A)

(B)

(C)

O perfil de proteases produzidas pelos isolados de T.harzianum foi analisado por eletroforese não desnaturante em pH alcalino. Uma isoforma de protease alcalina foi detectada para os isolados ALL 05, 08, 16, 18, 19, 28, 47 e 49, evidenciado pelo halo transparente de degradação da gelatina (Figura 3). As bandas protéicas correspondentes aos halos de degradação do substrato apresentaram padrão de migração diferente, sugerindo a secreção pelos isolados de formas diferentes de enzimas com atividade proteolítica (isoformas). Os isolados Tc, ALL 24 e 38 secretaram mais de uma forma de protease. Para o isolado ALL 20 foram detectadas duas isoformas não detectadas para os filtrados das culturas dos demais isolados (Figura 3).

Figura 3. Detecção de atividade proteolítica em gel de poliacrilamida a 10%(m/v) contendo gelatina a 0,5% (m/v) em condição não desnaturante, para os filtrados das culturas dos isolados T. harzianum : Tc, ALL-05, ALL-08, ALL-16, ALL-18, ALL-19, ALL-20, ALL-21, ALL-28, ALL-24, ALL-43, ALL-38, ALL-42, ALL-47 e ALL-49. As setas indicam as bandas protéicas com atividade proteolítica.

O filtrado da cultura do isolado ALL-49 apresentou maior valor de atividade proteolítica alcalina, além disto, este isolado dentre os demais citados neste trabalho apresentou percentuais de inibição do crescimento do fungo fitopatogênico F. oxysporum mais significativos (ARAÚJO, 2010). Considerando sua atividade antifúngica superior e o valor de atividade proteolítica, este isolado foi selecionado para os experimentos posteriores de avaliação da produção de hidrolases de parede celular fúngica, e como fonte de proteases visando o isolamento de uma protease com papel no micoparasitismo.

O isolado ALL 49 quando cultivado em meio de cultura contendo micélio de F. oxysporum como única fonte de carbono, também secretou as hidrolases de parede celular fúngica, β-1,3-glicanases, N-acetilglicosaminidases e quitinases. Os valores

T c _ALL 0 5 A LL 0 8 A LL 1 6 A LL 1 8 A LL 1 9 A LL 2 0 A LL 2 1 A LL 2 8 A LL 2 4 A LL 4 3 A LL 3 8 A LL 4 2 A LL 4 7 A LL 4 9

de atividade em U/mL obtidos foram: atividade proteolítica alcalina (1,99 U/mL), N- acetilglicosaminidases (4,281 x10-2 U/mL), β-1,3-glicanases (1,881 x10-2 U/mL) e quitinases (0,007 x10-2 U/mL) (Tabela 4).

Tabela 4. Determinação da atividade de hidrolases de parede celular presente no filtrado da cultura do isolado ALL-49, cultivado em meio mínimo líquido contendo o micélio de F.oxysporum como única fonte de carbono.

U/mL Atividade proteolítica alcalina 1,999

∗∗∗∗β−β−β−β−1,3-glicanase 1,881

∗∗∗∗N-acetilglicosaminidase 4,281

∗∗∗∗Quitinase 0,007

(∗∗∗∗)U/mLx 10-2.

A atividade proteolítica alcalina secretada por este isolado correspondente à produção de uma forma de protease alcalina apresentou maior atividade na faixa de temperatura entre 35° e 50°C, sendo a máxima a 45°C (Figura 4).

Figura 4. Efeito da temperatura na atividade proteolítica do filtrado da cultura do isolado ALL 49 na faixa de temperatura de 30° a 70°C. O isolado foi cultivado em meio de cultura contendo o micélio de

F.oxyporum com única fonte de carbono.

A estabilidade térmica desta enzima foi avaliada nas temperaturas de 45°C e 50°C, em intervalos de tempo entre 15 e 240 minutos . A enzima manteve 55% de sua atividade após 30 minutos de incubação a 45°C e m pH 8,0 e 48% após 30 minutos de incubação a 50°C em pH 8,0. A 45°C mesmo após 4 horas de pré-

incubação a enzima manteve 45% de sua atividade inicial, para 50°C a atividade detectada foi de 21% em relação à inicial (Figura 5). Os valores de atividade residual a 40ºC foram muito próximos dos obtidos para a pré-incubação a 45ºC (Figura 5).

Figura 5. . Estabilidade térmica da atividade proteolítica presente no filtrado da cultura do isolado ALL 49 a 40°( ), 45°(x) e 50°C ( ) de 0 a 240 minutos de pré-incubação.

Para verificar a faixa de pH ideal para a atividade proteolítica produzida pelo isolado ALL 49 foram realizados ensaios enzimáticos em tampões com diferentes valores de pH, mas com a mesma força iônica: acetato de sódio 50mM em pH 3, 3,5, 4, 4,5, 5 e 5,5; fosfato de sódio 50mM em pH 6, 6,5, 7, 7,5 e 8; Tris-HCl 50mM, pH’s 7, 7,5, 8, 8,5 e 9. A maior atividade proteolítica foi obtida na faixa de pH de 7,0 a 8,5 nos tampões fosfato de sódio e Tris-HCl, com a máxima atividade em pH 8,0 (Figura 6).

Figura 6. Efeito do pH na atividade proteolítica do filtrado da cultura do isolado ALL 49. O isolado foi cultivado em meio de cultura contendo o micélio de F.oxyporum com única fonte de carbono. Acetato de sódio 50mM (pH 3,0-5,0), fosfato de sódio 50mM (pH 6,0-8,0), Tris HCl 50mM (pH 7,0-9,0).

Uma protease alcalina produzida por este isolado foi purificada em dois passos cromatográficos, fenil- sefarose (interação hidrofóbica) e SP-sefarose (troca iônica). No primeiro passo de purificação a amostra (40mL) foi aplicada em uma coluna de interação hidrofóbica (fenil-sefarose,1,6 x 11 cm; fluxo contínuo de 60 mL/hora e fração de 4,0mL), equilibrada com tampão Tris-HCl 100mM contendo 1M de (NH4)2SO4. A atividade proteolítica foi eluída ao final do gradiente de sulfato de amônio (1-0M de (NH4)2SO4) e na lavagem da coluna com tampão Tris-HCl 100mM pH 8,0 (Figura 7A). As frações que apresentaram atividade proteolítica foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE). Neste gel, as frações 4, 5 e 6 apresentaram menos bandas protéicas, bem como, valores mais significativos de atividade proteolítica (Figura 7A e Figura 8). As frações correspondentes às amostras 4 a 7 foram reunidas e aplicadas em uma coluna de troca-iônica (3 x 10 cm; fluxo contínuo de 60 mL/hora e fração de 4,0mL) equilibrada com tampão Tris-HCl 100mM pH 8,0. Nesta coluna, a atividade proteolítica foi eluída na lavagem com o tampão, antes do gradiente. Não foi detectada atividade proteolítica para as amostras obtidas após aplicação do gradiente salino 0-1M de NaCl (Figura 7B).

Figura 7. Perfis cromatográficos das etapas de purificação da protease produzida pelo isolado ALL 49 e denominada TALP (Trichoderma “alkaline peptidase”). (A) Fenil-Sefarose equilibrada com tampão Tris-HCl 100mM pH 8,0 contendo 1M de (NH4)2SO4, (---) gradiente de (NH4)2SO4 0-1M; (•) Atividade de proteases alcalinas e (▫) perfil protéico. (B) SP-Sefarose equilibrada com tampão Tris- HCl 100mM pH 8,0; (---) gradiente de NaCl 0-1M; (•) Atividade de proteases alcalinas e (▫) perfil protéico. 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 82 86 Frações (número) A b so r b â n c ia ( 2 8 0 n m ) 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 U /m L (B) 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 2 8 14 20 26 32 38 44 50 56 62 68 74 80 86 92 98 104 Frações (número) A b so r b â n c ia 2 8 0 n m 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 U /m L (A)

MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 8. Análise eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) das frações cromatográficas provenientes da fenil-sepharose. (MM): marcador de massa molecular; 1 a 9: frações com atividade proteolítica (91 a 99).

As frações que apresentaram atividade proteolítica foram reunidas e analisadas em gel SDS-PAGE, sendo observada a presença de apenas uma banda protéica com massa molecular estimada de 29kDa (Figura 9). A protease alcalina purificada foi denominada TALP (Trichoderma alkaline protease).

MM 1 2

Figura 9. Análise eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) das frações cromatográficas provenientes da SP-Sepharose. (MM) marcador de massa molecular; (B) 1: “Pool” das frações com atividade proteolítica 8 , 9 e 10; 2: “Pool” das frações 11 e 12 com atividade proteolítica.

66 36 kD a 45 20 29 24 14.2 ← TALP 66 45 14.2 kDa 20 29 36

A banda protéica correspondente à protease purificada foi recortada do gel SDS-PAGE, descorada, digerida com tripsina e submetida à espectrometria de massa utilizando o espectrômetro de massa Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker Daltonics). Dois íons, picos principais, do espectro em MS foram selecionados, re- fragmentados e seqüenciados “de novo”. As seqüências obtidas apresentaram identidade com segmentos de serina proteases dos fungos filamentosos: Metarhizium anisopliae, Hypocrea lixii, Trichoderma hamatum e Hypocrea virens (Tabela 5). Para as três últimas espécies as enzimas caracterizadas possuem papel comprovado no micoparasitismo. Além disto, a identidade de seqüência foi obtida em domínios de aminoácidos conservados em motivos característicos de serina proteases “subtilisin-like”, aminoácidos 100 a 210 (Figura 10).

Tabela 5. Seqüências dos fragmentos trípticos da protease alcalina purificada (TALP) determinadas por seqüenciamento “de novo”.

Seqüência Íon(m/z) Proteína

correspondente Microorganismo Código de acesso TQNCVHGTVSHR 1338.6 Serina protease “subtilisin-like” Metarhizium anisopliae var. acridum CAC95048.1

DTSHQQFNR 1132.21 Serina endoprotease Hypocrea lixii CAL25580.1

Protease alcalina Trichoderma hamatum AAP15044.1

(A) 1)100IKSSPDVASVEPDYIMYLSDIVEDKRALTTQTGAPWGLGTVSHRTSGSTSYIYDTSAGSGT149 2)100IKASPDVASVEPDYIMYLSDIVEDKRALTTQTGAPWGLGTVSHRTSGSTSYIYDTSAGSGT149 3)100IKSSPDVASVEPDYIMYLSDIVEDKRALTTQSGAPWGLGTVSHRTSGSTSYIYDSSAGSGT149 ---TQNCV----HGTVSHR--- 4)100IRRNADVESVEQQQLYHLH--ELTTQKNSTHGLATVSHREPGSTEYVYDSRAGEGS (B) 1)160YAYVVDSGINTSHQQFGGRATLGYNAAGGQHVDTLG-HGTHVSGTIGGSTYG210 2)160FAYVVDSGINTSHQQFGGRASLGYNAAGGQHVDTLG-HGTHVSGTIGGSTYG210 3)160FAYVVDSGINTSHQQFGGRASLGYNAAGGQHVDTLG-HGTHVSGTIGGSTYG210 ---DTSHQQFN-R--- 4)160TVYVLDSGIQLDHPEFEGRAIHGYNAVKGETDDDVQGHGTHVAGIVGSKTYG210 (C)

Figura 10. Alinhamento múltiplo (A) e (B) das seqüências de serina proteases com maior similaridade com os peptídeos da proteína TALP obtidos por seqüenciamento “de novo”, na região de aminoácidos conservados em domínios típicos de serina peptidases “subtilisin-like” (C). As seqüências que apresentaram identidade com segmentos de serina proteases dos fungos filamentosos: Hypocrea lixii (1), Hypocrea virens (2), Trichoderma hamatum (3) e Metarhizium

6.DISCUSSÃO

Os isolados de T. harzianum utilizados (ALL05, ALL08, ALL16, ALL18, ALL19, ALL20, ALL21, ALL22, ALL24, ALL28, ALL42, ALL43, ALL47 e ALL49) neste trabalho foram descritos por Araújo (2010) como potenciais agentes para o biocontrole do fungo fitopatogênico F. oxysporum, em função da atividade apresentada na inibição de seu crescimento. Dentre os isolados caracterizados neste trabalho o ALL-24 e o ALL-49 apresentaram valores mais significativos de atividade inibitória contra o fungo hospedeiro, indicando o seu potencial de utilização no desenvolvimento de formulados para o controle de doenças causadas por este fungo.

A constante seleção de novos agentes de biocontrole é essencial para o desenvolvimento de estratégias mais eficientes no controle de doenças fúngicas, uma vez que produtos desenvolvidos com isolados de regiões com condições climáticas e pressão biótica diferentes não apresentam uma boa taxa de redução de incidência destas doenças, em qualquer tipo de habitat. Desta forma, a eficiência de um agente de biocontrole também está relacionada à sua capacidade de se manter sob as pressões bióticas e abióticas do solo no qual será introduzido (WOO & LORITO, 2007; VINALE et al., 2008; FISCHER et al., 2010).

Estes novos isolados com capacidade de adaptação às condições de estresse biótico e abiótico da Região Centro-Oeste e com atividade antifúngica contra fungos fitopatogênicos que impactam na sua produção de grãos, também são fonte de novos genes com atividade antifúngica que podem ser utilizados no desenvolvimento de cultivares e agentes de biocontrole, mais resistentes a doenças fúngicas e com maior atividade de biocontrole, respectivamente. Dentre os genes candidatos tem-se os que codificam as hidrolases de parede celular fúngica (β-1,3- glicanases, quitinases e proteases). Já existem dados na literatura que mostram que linhagens de Trichoderma superprodutoras de serina proteases apresentam aumento significativo na sua atividade de biocontrole contra diferentes fungos fitopatogênicos (FLORES et al., 1997; POZO et al., 2004).

A produção de proteases ácidas, neutras e alcalinas pelos 15 isolados de T.harzianum foi avaliada após o cultivo em meio de cultura contendo o micélio de F. oxysporum como única fonte de carbono. Os valores mais significativos para a atividade proteolítica alcalina foram detectados para os isolados ALL-49(1, 99 U/mL) e 28(1,60 U/mL), respectivamente. Este perfil foi alterado para as atividades em pH

neutro e ácido. Em pH neutro, os valores de atividade mais significativos foram obtidos para os isolados ALL 47(2,01 U/mL), 49(1,65 U/mL), 43(1,59 U/mL), 05(1,37 U/mL) e 28(1,29 U/mL) e em pH ácidos para os isolados ALL-05 (0,66 U/ mL), 49 (0,47 U/ mL), 28 (0,43 U/ mL), Tc (0,41 U/ mL), 08 (0,37 U/mL) e 24 (0,36 U/ mL), nesta ordem. Independentemente do pH utilizado para o ensaio enzimático a maior parte destes isolados apresentaram atividade proteolítica superior ao isolado Tc já caracterizado como um agente de biocontrole de fungos fitopatogênicos. Para o ALL 49 e 28 os dados de produção de proteases correlacionam com a maior inibição do fungo F. oxysporum, sugerindo que para estes isolados a atividade proteolítica pode ser um fator de patogenicidade secretado pelo fungo micoparasita.

A produção de hidrolases de parede celular fúngica por espécies do gênero Trichoderma já foi descrita como uma importante etapa para a sua atividade e ação micoparasita contra fungos fitopatogênicos (BENÍTEZ et al. , 2004; ALMEIDA et al., 2007). A expressão dos genes que codificam estas enzimas é regulada nas diferentes espécies de Trichoderma, dependendo da fonte de carbono na qual é cultivada o fungo, assim como da presença de um fungo hospedeiro (STEYAERT et al., 2004). Os níveis de expressão destas hidrolases são aumentados quando o micoparasita é cultivado em meio contendo quitina ou paredes celulares de fungos fitopatogênicos como fonte de carbono. Como exemplo de fitopatógenos que já foram utilizados como fonte de carbono tem-se: Pythium ultimum, Botrytis cinerea e Rhizoctonia solani (SUÁREZ et al., 2005); R. solani (ALMEIDA et al., 2007; TSENG et al. 2008), B. cinerea YANG et al., 2009); F.solani, (RAMADA, 2010); R. solani, Macrophomina phaseolina e Fusarium sp. (MONTEIRO et al., 2010).

Com relação à produção de proteases alcalinas, Geremia et al. (1993) demonstraram que a glicose atua como um repressor de sua expressão em T. harzianum. Além disto, os genes que codificam as serina proteases PRA1, PRB1 e Tvsp1 são induzidos em condições que simulam o micoparasitismo, assim como na presença de parede celular ou micélio dos fungos fitopatogênicos como R.solani (GOLDMAN & GOLDMAN, 1998; GEREMIA et al., 1993; POZO et al., 2004) e B. cinerea (SUAREZ et al. 2007). E conforme o sucesso de ação, a atividade antagônica poderá ser aumentada em isolados hiperprodutores de proteases que superexpressam genes que codificam enzimas hidrolíticas da parede celular do patógeno. Como por exemplo, a superexpressão do gene prb1 em T. atroviride (FLORES et al., 1997) e a superexpressão de tvsp1 em T. virens, gene que codifica

uma serina protease alcalina extracelular em uma linhagem comercial de Trichoderma que não afeta nenhuma de suas funções essenciais, importante para o desenvolvimento do fungo antagonista e nem altera sua viabilidade no processo de controle biológico, devido o índice da doença ter sido bastante reduzido(POZO et al. 2004). A superexpressão destes genes indutores da hiperprodução de proteases alcalinas evidencia o aumento significante da capacidade de algumas cepas de protegerem plântulas de algodoeiro contra R. solani.

Bioagentes que apresentam a atividade proteolítica em diferentes pH’s como encontradas para os isolados ALL 05 e ALL 28 também são bastante relevantes mesmo porque denotam uma característica de interesse para seleção de linhagens de bioagentes que apresentam esse potencial de eficiência em agir sob condições adversas. Estas enzimas com atividade proteolítica atuam na hidrólise da parede celular do hospedeiro, bem como na degradação dos fatores de patogenicidade próteicos secretados pelos fungos fitopatogênicos e importantes para estabelecimento da infecção fúngica na planta hospedeira (ELAD & KAPAT 1999; FLORES et al. 1997; POZO et al. 2004; ROCHA-RAMÍREZ et al., 2002; SILVA et al., 2004; SUÁREZ et al. 2004; VITERBO et al. 2004 e SUÁREZ et al. 2007).

O perfil de proteases produzidas pelos isolados de T.harzianum na presença do micélio de F.oxysporum foi analisado por eletroforese não desnaturante em pH alcalino. Uma isoforma de protease alcalina foi detectada para os isolados ALL 05, 08, 16, 18, 19, 28, 47 e 49 (Figura 3). As bandas protéicas correspondentes aos halos de degradação do substrato apresentaram padrão de migração diferente, sugerindo a secreção pelos isolados de formas diferentes de enzimas com atividade proteolítica (isoformas). Os isolados Tc, ALL 24 e 38 secretaram mais de uma forma de protease. Para o isolado ALL 20 foram detectadas duas isoformas não detectadas para os filtrados das culturas dos demais isolados.

Este resultado está de acordo com o observado para β-1,3-glicanases e quitinases de espécies de Trichoderma. Noronha et al. (2000) demonstraram que isoformas de β-1,3-glicanases são secretadas dependendo da fonte de carbono testada e a expressão de uma das isoformas, denominada GLU36, é reprimida por glicose e aumentada por β-1,3-glicanas e parede celular fúngica. Sugerindo que existem isoformas específicas desta enzima relacionadas à atividade micoparasita. Análises de secretoma e transcriptoma de T. harzianum também têm descrito a

expressão de isoformas específicas de β-1,3-glicanases, quitinases, proteases alcalinas e ácidas em condições que simulam o micoparasitismo (NORONHA et al. ,2002; ARAÚJO, 2010; MONTEIRO et al. , 2010; RAMADA; 2010).

O isolado ALL-49, maior produtor de atividade proteolítica alcalina e com atividade inibitória mais significativa contra F. oxysporum, quando cultivado em meio de cultura contendo o micélio do hospedeiro como única fonte de carbono secretou, além da atividade proteolítica alcalina, as atividades de quitinases, N- acetilglicosaminidades e β-1,3-glicanases. Estando de acordo com outros trabalhos que demonstram a correlação entre atividade antagônica e produção de hidrolases de parede celular fúngica. Além do papel do micélio ou parede celular do fungo hospedeiro como indutor da expressão destas atividades (MONTEIRO et al., 2010; RAMADA; 2010).

A atividade proteolítica alcalina deste isolado advém de apenas uma forma de protease secretada no meio de cultura indutor, que apresentou maior atividade na temperatura de 45°C e pH 8,0. Dados semelhantes for am encontrados para proteases alcalinas de T.koningii, T. reesei e T.harzianum com temperatura ideal na faixa de 40 a 50°C (MANONMANI & JOSEPH, 1993; DIENE S et al., 2007; HAGGAG et al.,2006; DUNAEVSKY et al. 2006 apud ŠIMKOVIČ et al., 2008). Com relação ao pH ótimo a protease do ALL 49, apresentou atividade proteolítica significativa em pH 8, diferindo dos valores encontrados para uma protease “subtilisina-like” de T.harzianum descrita por Haggag et al.(2006) com atividade máxima em pH 6,5 e para a serina protease de T.koningii, pH 10,5 (MANONMANI & JOSEPH, 1993). No entanto, este valor foi coincidente com o obtido para uma protease de T. harzianum descrita por De Marco e Felix (2002) e uma serina protease “tripsina-like” de T. reesei (DIENES et al., 2007). Dunaevsky e colaboradores (2006 apud ŠIMKOVIČ et al., 2008) também purificaram uma serina protease do tipo subtilisina produzida por T.harzianum que apresentou dois máximos de atividade distinta, em pH 7,5 e 10,0, e estabilidade na faixa de pH 6,0-11,0. Todos estes valores estão dentro da faixa de atividade esperada para serina proteases, geralmente mais ativas em valores de pH neutro e alcalinos, com um pH ótimo entre 7 e 11.

Por agirem neste intervalo de pH, estas proteases apresentam relevância no uso industrial no processamento, limpeza e desinfecção de diversos materiais e por isso tem sido bastante utilizada na indústria de detergentes. Como por exemplo, em

lavagem de têxteis, lentes de contato, limpeza de equipamentos hospitalares e dentre outros. Compostos de proteases alcalinas também têm sido empregadas em processamento de couro, indústria de alimentos, indústria farmacêutica e controle de patógenos. Assim como a atividade em diferentes pH é significante para uma protease, a ação da mesma em amplas faixas de temperatura também. E devido a esse motivo a seleção linhagens de Trichoderma mais eficientes têm sido investigadas e escolhidas como alvo para transformantes superprodutores destas enzimas hidrolíticas com finalidade de melhorar a capacidade antagônica em controlar patógenos que causam prejuízos em culturas vegetais de interesse econômico e nutricional, como por exemplo, lavouras de algodão (HOWELL, 2003; POZO et al., 2004) cacau (De MARCO e FELIX, 2002), cebola (HAGGAG et al.,2006) e entre outros. O uso destas enzimas como produto biotecnológico colabora para a redução de contaminantes, resíduos e efluentes industriais tóxicos (RAO et al., 1998;OMERO et al., 1999; FELIX et al., 2004 ; VITERBO et al., 2004).

A protease alcalina purificada neste trabalho possui atividade em faixas de pH e temperatura coincidentes com outras proteases de T. harzianum, mas valor de massa molecular distinto (29 KDa, estimada por eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE). A protease purificada por De Marco e Felix (2002) possui massa molecular de 18,8 kDa, sendo que esta proteína foi secretada quando o fungo foi cultivado em meio líquido contendo caseína como única fonte de carbono. Enquanto que a purificada por Dunaevsky e colaboradores (2006 apud ŠIMKOVIČ et al., 2008) tem 73kDa. Além disto, os isolados utilizados nestes trabalhos como fonte de protease foram isolados de amostras de solo. As diferenças nos valores de massa molecular destas proteínas e a fonte de carbono utilizada para o cultivo dos fungos sugerem que a protease purificada neste trabalho, denominada TALP (“Trichoderma alkaline protease’) se trata de uma protease diferente das já descritas.

A identidade de sequências da proteína TALP com seqüências de serina proteases do tipo subtilisina sugere que esta enzima pertence a esta família. As serina proteases do tipo subtilisina já foram anteriormente caracterizadas como atuantes no micoparasitimos de espécies de Trichoderma e de Hypocrea. Como a prb1 de Hypocrea lixii, tspv 1de T. harzianum e duas outras serina proteases de T. hamatum e T. virens (STEYAERT et al., 2004; SUÁREZ et al., 2007; POZO et al., 2004). A secreção da TALP em condição que simula o micoparasitismo, e sua identidade com seqüências de serina proteases do tipo “subtilisina-like” com papel já

descrito neste processo, sugerem o seu envolvimento no mecanismo de micoparasitismo do isolado ALL 49 contra F. oxysporum. E, portanto, o seu potencial de utilização no desenvolvimento de agentes de biocontrole mais efetivos no controle da murcha de fusário ou de cultivares mais resistentes a esta doença.

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