Conclusion and Future Work
6.1 Future Work
6.1.3 Improve Monitoring System
O padrão proteico das frações obtidas por RP-HPLC, observado por SDS-PAGE (Figura 9A), mostra em SiAMP2 um padrão de duas bandas distintas, uma com aproximadamente 6 kDa e outra acim a desta com menos de 14 kDa. Os dados de MS confirmaram a massa monoisotópica das duas subunidades de SiAMP2 como sendo 5.874 e 8.374 Da. O sequenciamento de SiAMP2 por degradação de Edman e espectrometria de massa permitiu uma cobertura de 86% da sua sequência completa de aminoácidos. A sequência parcial de SiAMP2 mostrou distintos graus de similaridade com albuminas 2S (dados não mostrados), em particular uma similaridade (49%) com sesina (GenBank ID: AAK15088; UniProtKB ID: Q9AUD1), uma albumina 2S de 153 aminoácidos oriunda de sementes da mesma planta de qual SiAMP2 foi purificada (TAI et al., 2001). Como esperado, uma vez que albuminas 2S são codificadas por uma família multigênica, os dados apresentados aqui indicam a síntese de diferentes isoforma s de albuminas 2S. Adicionalmente, a análise por IEF demonstrou que SiAMP2 possui um pI levemente catiônico de aproximadamente 7,8 (Figura 9B)
Figura 9: A. Perfil proteico das frações resultantes do RP-HPLC de PR. M corresponde a linha de
corrida do marcador de massa molecular. A porcentagem de CH3CN de eluição é indicada abaixo da linha onde foi aplicada cada fração cromatográfica. A seta pontilhada indica a raia de SiAMP2. B. Focalização isoelétrica de SiAMP2, evidenciada onde indicado pela seta. Os valores à direita correspondem ao marcador de pI.
4.9.3 Relação estrutura-atividade antimicrobiana na família albumina 2S
Inicialmente, um alinhamento múltiplo foi re alizado com nove sequências completas de albuminas 2S (Figura 10). Entre elas estão a sesina, 1psy (PANTOJA-UCEDA et al., 2003), modelo estrutural para SiAMP2, e sete 2S-AMPs sequenciadas completamente e presentes no data set de albuminas 2S (BROEKAERT et al., 1993; TAI et al., 1999; PRASAD, 2000; YANG et al., 2004; VASHISHTA et al., 2006). O modelo de SiAMP2 foi construído a partir das coordenadas atômicas de 1psy, uma albumina 2S de R. communis com estrutura tridimensional definida por RMN e maior similaridade à SiAMP2. Em primeira análise, fica evidente a alta frequência de glutamina em todas as sequências. Entretanto, não há conservação na posição das glutaminas no alinhamento ou ainda no número de glutaminas que constituem cada domínio. Em uma avaliação mais aprofundada, os resíduos conservados ao longo do alinhamento foram identificados e uma análise estrutural de SiAMP2 foi realizada para a elucidação de quais resíduos cons ervados estão expostos na estrutura e possivelmente envolvidos com a atividade antimicrobiana.
Figura 10: Alinhamento múltiplo da sequência parcial de SiAMP2 e das 2S-AMPs completamente sequenciadas, com maior similaridade a SiAMP2. O padrão de cisteínas
comum a albuminas 2S e seu alinhamento dentre as sequências analisadas é claramente observado, bem como a falta de conservação no posicionamento e tamanho dos domínios de glutaminas. Os resíduos de aminoácido com conservação parcial e expostos na estrutura tridimensional de SiAMP2 são indicados por retângulos.
Organismo ID Sequência Referência
S. indicum SiAMP2 QEGCEWE--SRPC-NRGC--WLPRQWESVHMRFGVLVLWR This report S. indicum AAK15088 22 ----TTYTTTVTTTAIDDEANQQSQQCRQQ--LQGRQFRSCQRYL-SQGRSPYGGEEDEVLEMS--- 79 (TAI et al., 2001) S. indicum Q9XHP1 22 ----SAHKTVVTTSVAEEGEEENQRGCEWE--SRQCQMRHCMQWM-RSMRGQY---EESFLRSA--- 73 (TAI et al., 1999) L. japonicas AAW66631 01 ---MLQGRQFRSCQSYL-RQ---RGNVLEM--- 24 (YANG et al., 2004) H. annus CAC81359 34 ---HTTIITTTIEDENPLSEQRQCIQQVQGQR--LNQCRMFL--QQGQRGQQHQ--- 81 (PRASAD, 2000) H. annus CAC81359 158 ---IDIPFRDRPFGRSQQCS-ETEIQR-PVSQCQRYV-KQQMQSPMPYIRRPGQ--- 206 (PRASAD, 2000)
M. charantia CAD32938 23 ---YRTTITTVEVDEDNQGRHERCHHIRPREQ--LRSCESFL-RQS---RGYLEMKGVE--- 73 (VASHISHTA et al., 2006) R. sativus CAA01774 22 SIYRTVVEFDEDDATNPAGPF-RIPRCRKEFQQAQ-HLRACQQWLHKQAMQVRGGPSL-ALDGEFDFEDD 89 (BROEKAERT et al., 1993) M. jalapa CAA01775 28 ---SAGPF-RIPRCRREFQQAQ-HLRACQQWLHRQARQSG--- 63 (BROEKAERT et al., 1993) R. communis 1PSY 01 ---AEFMESKGEREGSSSQQCRQEVQRKD--LSSCERYL-RQSSSRRSTGEE-VLRMPGD---- 53 (PANTOJA-UCEDA et al., 2003)
S. indicum SiAMP2 APQFEHFRECCNELR CEALRCMMR MRMEYWPRGLQDQQVYQRARDLEPRKH-CGMSYPVECRMPR
S. indicum AAK15088 80 TGNQQSEQSLRDCCQQLR-NVDER--CRCEAIRQAVR---QQQQEGGYQEGQS--QQVYQRARDL-PRR--CNMR-PQQCQFRVIFV--- 132 S. indicum Q9XHP1 74 EANQGQFEHFRECCNELR-DVKSH--CRCEALRCMMR---QMQQEYGMEQ-EMQQMQQMMQYL-PRM--CGMSYPTECRMRPIFA--- 148 L. japonicus AAW66631 25 TGNPQS-QTVEECCESLKDIERKQQQCGCEAIKHAMR---QMQGGQSE--EVYRKARML-PRT--CGLR-SQQCQFNVIFV--- 95 H. annus CAC81359 82 --QQQEQQLLQQCCQEL-QNIDQQ--CQCEAVKQVFR----EAQQQVQQQQGRQSVPFRSSQQT-QQ-LQKAQIL-PNV--CNLQ-SRRCEIGTITTTVVTESN 157 H. annus CAC81359 207 --QQQEPE-LQQCCNQL-QNVNRE--CQCEAVQEVARRVMRQPQQH---QQQQRRRGQFGGQEM-DIARRVIQNL-PNQ--CDLE-VQQCNIPY--- 285 M. charantia CAD32938 74 ENQWERQQGLEECCRQLR-NVEEQ--CRCDALQEIAREVQRQ---ERGQEG-SQMLQKARML-PAM--CGVR-PQRCDF--- 140 R. sativus CAA01774 90 MENPQRPPLLQQCCNELHQEEPL---CVCPTLKGASKAVK---QQIQQQQGQQQAHQRMVSRIYQTATHL-PRV--CNIPQVSVCPFQKTMPGPYY--- 175 R. communis 1PSY 54 ENQQQESQQLQQCCNQVKQ-VRDE--CQCEAIKYIAE---DQIQQGQLHGEESERVAQRAGEI---VSSCGVR----CMRQTRTN--- 125
4.9.3.1 Análise da estrutura tridimensional de albuminas 2S de gergelim, SiAMP2
Através de modelagem comparativa, a estrutura tridimensional de SiAMP2 foi predita e validada (GA341: 0,99991 DOPE: -8.376,60059), utilizando como molde a estrutura de 1psy (PANTOJA-UCEDA et al., 2003),
com 40% de identidade a SiAMP2. O modelo de SiAMP2 consiste em cinco α-
hélices arranjadas em uma super-hélice no sentido anti-horário (mão-direita), motivo comum à maioria de albuminas 2S. Ainda, possui oito cisteínas, das
quais seis envolvidas na formação de ligações dissulfeto Cys11–Cys57,
Cys23–Cys46, Cys47–Cys94. As duas primeiras fazem a ligação entre a s
subunidades menor e maior, enquanto que a terceira é uma ligação intercadeia na subunidade maior. A minimização de energia foi realizada através do software GROMACS em parâmetros padrão, tendo sid o necessárias 576 etapas para alcançar a energia total de 1.000,0 kJ.mol- 1.min- 1. O modelo final foi utilizado nas demais análises. O potencial eletrostático calculado com o APBS é a maior parte catiônico, com poucas regiões negativas devido à baixa presença em SiAMP2 de resíduos de aspartado e glutamato (Figura 1 1A). A carga total de SiAMP2 calculada a partir do arquivo de topologia gerado pelo GROMACS foi de +2 (qtot: 2). Dentre os resíduos previamente identificados como conservados entre as 2S -AMPs, resíduos de arginina são encontrados expostos na estrutura tridimensional de SiAMP2 nas posições 87, 91, 110, 112, 116 e 117 (Figura 11B). Da mesma forma, resíduos de aminoácidos aromáticos também são encontrados expostos, formando um pequeno domínio predominantemente hidrofóbico entre as hélices IV e V (Figura 1-4B).
Figura 11: A. Potencial eletrostático da estrutura tridimensional de SiAMP2. A região da superfície carregada negativamente está colorida de vermelho e a
carregada positivamente em azul. A carga total calculada foi de +2. B. Estrutura tridimensional de SiAMP2 predita por modelagem comparativa com 1psy como modelo, através do software Modeller 9v7, submetido a 576 etapas de minimização de energia. Os resíduos de aminoácidos com parcial conservação entre as 2S-AMPs, expostos na estrutura proteica de SiAMP2 e possivelmente envolvidos com a atividade antimicrobiana estão identificados.
4.9.4 Análises filogenéticas
Visando estabelecer uma relação evolutiva entre as diferentes funções biológicas descritas para as proteínas albuminas 2S, uma análise filogenética foi realizada. Para tanto, um data set foi criado a partir da compilação de todas as albuminas 2S depositadas no banco de proteínas do NCBI, com redundância limitada a 85% para evitar isoformas. As informações contidas no arquivo FASTA de cada sequência foram cuidadosamente incluídas no data set, como o número de acesso no NCBInr, a atividade biológica e o organismo de origem. O data set completo foi composto por 102 sequências de aminoácidos de albuminas 2S. Entre estas, 69 sequências estavam anotadas como proteínas de reserva; 17 como alergênicas; duas como inibidoras de tripsina; duas como inibidoras de α-amilase; duas como inativadoras de ribossomo; e as últimas 10 como proteínas antimicrobianas. O data set foi submetido à reconstrução filogenética utili zando o método de MP (ECK, 1966) (Figura 12). A partir da análise da árvore filogenética, fica evidente que existe uma relação filogenética mais próxima entre as proteínas de gêneros relacionados do que aquelas com função biológica relacionada. Portanto, a atividade antimicrobiana é livremente distribuída na á rvore de albuminas 2S, sem aparente relação com nenhum padrão de sequências de aminoácidos.
Figura 12: Árvore de relação evolutiva de albuminas 2S. A história evolutiva foi inferida usando o método de
máxima parsimônia. Triângulos indicam as proteínas com atividade antimicrobiana; quadrados, inibidores de ribossomos; círculos, inibidores de α-amilase; e losangos, inibidores de tripsina.
4.10 CAPÍTULO 2: RESISTÊNCIA BACTERIANA A PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS
4.10.1 Ensaios de susceptibilidade antibacteriana
Inicialmente, o perfil de crescimento de E. coli ATCC 8739 foi estabelecido sob condições experimentais (Figura 13A), permitindo correlacionar a DO de 0,05 UA à 5 x 105 UFC.mL- 1. Esta carga bacteriana foi definida como o inóculo inicial nos ensaios de susceptibili dade antibacteriana. Então, a cepa da bactéria E. coli ATCC 8739 foi desafiada contra o peptídeo antimicrobiano magainina I , tendo seu MIC sido determinado como 31 µ M, a partir de ensaios com concentrações entre 0,5- 41,5 µ M. Portanto, o valor correspondent e a ½ MIC foi 15,5 µ M. Como previamente descrito, após dez propagações sucessivas em ½ MIC de magainina I, três colônias de E. coli foram isoladas e tiveram sua susceptibilidade avaliada contra o MIC completo de magainina I. Todos os isolados resistentes apresentaram crescimento e desenvolvimento regular na presença do peptídeo antimicrobiano. De fato, no ensaio em meio líquido, o crescimento dos isolados resistentes foi similar ao desenvolvimento observado para E. coli em meio livre de antibióticos. No ens aio em meio sólido, a formação de colônias a partir dos isolados resistentes também foi positiva. De acordo com estes dados , a resistência à magainina I foi obtida em três colônias isoladas, nomeadas R1, R2 e R3. Concomitantemente, as colônias susceptíveis a magainina I (C1, C2 e C3), isoladas após dez propagações sucessivas em meio livre de antibiótico , não apresentaram crescimento tanto em meio líquido quanto sólido contendo o MIC completo da magainina I.
4.10.2 Crescimento bacteriano e avaliação de resistênc ia cruzada
As seis colônias isoladas (C1 -3 e R1-3) foram comparadas com a colônia original (E. coli ATCC 8739) quanto ao seu desenvolvimento em meio LB líquido livre de antibióticos (Figura 13B). Apesar da diferença evidente quanto à propriedade de resistência, foi observado um padrão de crescimento similar em todos isolados avaliados, alcançando o final da fase exponencial com 120 min de incubação. Esta fase representa a maior concentração de células viáveis e, coincidentemente, maior secreção proteica para quase todos os isolados (Figura 13C). A única exceção consistiu no isolado R3 que apresentou maior secreção de proteínas aos 150 min. Portanto, 120 min foi o ponto no qual as células bacterianas foram coletadas nos experimentos subsequentes.
Os isolados C1-3 e R1-3 também foram avaliados e comparados quanto a sua susceptibilidade aos agentes antimicrobianos de uso padrão contra Enterobacteriaceae (CLSI, 2010). Entretanto, ambos os isolados , resistentes e susceptíveis a magainina I, não diferem no resultado dos ensaios de teste difusão das oito classes de antibióticos testadas (Tabela 1), indicando não haver resistência cruzada.
curvas de crescimento e C. secreção proteica de EC, E. coli ATCC 8739; C1-3, isolados de E. coli susceptíveis a magainina I; R1-3, isolados de E. coli resistentes a magainina I. Pontos experimentais do monitoramento de DO até 600 min foram omitidos para manter a clareza da figura.
Tabela 1: Resultado do teste difusão de susceptibilidade antibiótica dos diferentes isolados de E. coli.
Os diâmetros dos halos de inibição são indicados, bem como a interpretação desses valores em termos de susceptibilidade.
Halos de inibição (cm) e susceptibilidade ao agente antimicrobiano
Conteúdo do disco C1 C2 C3 R1 R2 R3
Ampicilina 10 µg 1,5 (I) 1,4 (I) 1,5 (I) 1,5 (I) 1,5 (I) 1,4 (I) Aztreonam 30 µg 1,9 (I) 1,9 (I) 2,0 (I) 2,0 (I) 2,0 (I) 2,0 (I) Cefalotina 30 µg 1,1 (R) 1,3 (R) 1,3 (R) 1,1 (R) 1,4 (R) 1,3 (R) Ciprofloxacina 5 µg 2,5 (S) 2,6 (S) 2,8 (S) 2,8 (S) 2,6 (S) 2,4 (S) Cloranfenicol 30 µg 1,9 (S) 2,2 (S) 1,8 (S) 2,2 (S) 2,0 (S) 2,2 (S) Gentamicina 10 µg 1,5 (S) 1,5 (S) 1,5 (S) 1,6 (S) 1,7 (S) 1,7 (S) Imipenem 10 µg 1,9 (R) 1,9 (R) 1,8 (R) 1,9 (R) 1,9 (R) 1,9 (R) Tetraciclina 30 µg 2,2 (S) 2,3 (S) 1,9 (S) 2,3 (S) 2,3 (S) 2,0 (S) C1-3: isolados de E. coli susceptíveis a magainina I; R1-3: isolados de E. coli resistentes a magainina I; R, resistente; S: susceptível; I: intermediário.
4.10.3 Proteômica comparativa entre isolados de E. coli resistentes e susceptíveis a magainina I
Visando obter a concentração proteica necessária para quatro réplicas técnicas de géis 2-DE, nitidamente visíveis quando corados em coomassie blue, para cada um dos três subproteomas (membrana externa, citoplasma e secreção), os isolados C1-3 e R1-3 foram submetidos à produção de alta densidade celular por 8 L de fermentação descontínua, sob as condições previamente descritas. Esta estratégia mostrou -se extremamente eficiente na obtenção de proteínas citosólicas, com rendimento próximo a 400 mg totais de proteínas, mais do que suficiente para o s experimentos proteômicos. Entretanto, o rendimento de OMP meramente alcançou 300 µ g totais, cinco vezes mais que o rendimento do ex perimento em pequena escala, ma s ainda distante do ideal para a realização de géis 2-DE, como exposto em seguida.
Inicialmente, as análises eletroforéticas foram realizadas por SDS - PAGE (Figura 14). Em análise visual das proteínas citosólicas, é possível observar uma alta densidade proteica com MM variando entre 14 e 116 kDa (Figura 14A). Entre as OMP, a distribuição proteica é observada na mesma variação de massa, porém com menor densidade proteica (Figur a 14B). Enquanto que no secretoma, a maior concentração de proteínas apresentou MM abaixo de 66,2 kDa (Figura 14C). A forma e alta definição das bandas foram indicadores positivos da integridade das proteínas. Entretanto, o padrão proteico de MM observado foi basicamente idêntico entre isolados resistentes e susceptíveis à magainina I, para ambos os subproteomas, impossibilitando a utilização destes dados para o estudo proteômi co comparativo relacionado aos mecanismos de resistência bacteriana.
Figura 14: Perfil de massa molecular obtido por SDS-PAGE 12% de A. proteínas citosólicas, B.
proteínas de membrana externa e C. proteínas de secreção bacteriana. M indica a raia correspondente ao marcador de massa molecular, valores apresentados em kDa. R1-3 correspondem aos isolados resistentes a magainina I, e C1-3, aos isolados susceptíveis.
De modo a detectar diferenças significa tivas entre os padrões proteicos dos isolados resistentes e susceptíveis, os experimentos 2 -DE foram realizados e mapas proteicos com resolução aceitável para proteínas citosólicas foram obtidos, para todos os seis isolados. Os géis de secretoma não apresentaram definição suficiente, aparentemente causada p or excessos interferentes na amostra, resultando em baixa qualidade de focalização isoelétrica. Ainda, os géis 2-DE de OMPs apresentaram baixíssima contagem de spots proteicos e pouca reprodutibilidade entre as réplicas técnicas, aparente resultado de baix a concentração proteica e má focalização isoelétrica. Dessa forma, a continuidade das análises proteômicas foi restrita a proteínas citosólicas. As proteínas coradas com coomassie tiveram seu pI e MM calculados, apresentando alta concentração ao longo da f aixa de pH ácido, 3,5-6,8, e MM entre 25-66 kDa (Figura 15). Tréplicas dos géis 2-DE foram selecionadas para cada um dos isolados e subsequentemente submetidas
às análises comparativas in silico, apresentando os valores médios de R2:
C1=0,83; C2=0,89; C3=0,83; R1=0,88; R2=0,92; e R3=0,93. O grupo controle
com maior valor de R2, C2, foi selecionado como representante do grupo
controle para as demais análises comparativas com os isolados resistentes. Um total de 187 spots proteicos diferentes foi detectado, incluindo spots de ambos os isolados resistentes e susceptíveis, dos quais proteínas de 58 spots foram identificadas como diferencialmente expressas em isolados resistentes a magainina I ao considerar significância de p < 0.05 (Figura 15). Todos os spots proteicos diferenciais foram digeridos enzimaticamente com tripsina e submetidos à espectrometria de massa, dos quais proteínas de 53 spots foram identificadas por sequenciamento de novo dos espectros de MS/MS (Tabela 2). As proteínas destes spots foram identificadas como 41 proteínas diferentes e algumas isoformas, as quais apresenta ram a mesma identificação, mas pequenas variações em pI e MM. Do total de spots proteicos diferenciais, R1 apresentou 22 proteínas distintas em 24 spots, dos quais as proteínas de oito foram reguladas positivamente, de cinco reguladas negativamente, de quatro não detectadas em R1 e de sete spots apenas detectadas neste isolado. Os géis de R2 apresentaram 30 proteínas diferenciais correspondentes a 38 spots proteicos, dentre os quais as proteínas de 12 spots foram reguladas positivamente, de oito negativamente, de três não detectadas em R2 e de
outros três spots apenas encontradas em R2. Finalmente, R3 apresentou a identificação 35 proteínas diferenciais resultado de 44 spots proteicos, sendo que as proteínas de 13 spots tiveram regulação positiva, de seis apresentaram regulação negativa, de dois não foram detectadas em géis R3, enquanto que as proteínas de 22 spots foram detectadas apenas em R3.
Tabela 2: Identificação das proteínas diferencialmente expressas em isolados de E. coli resistentes a magainina I, agrupadas por função. A identificação
proteica foi obtida através da combinação de PMF e sequenciamento de novo dos espectros MSMS.
ID Spot Proteína Identificada ID NCBI MM
Teórico MM Exper. pI Teór. pI Exper. Nº Pep. de novo % Seq. Metabolismo Energético 1 176 177
Chaperona molecular DnaK (K04043) YP_001726580.1 69114 69312
78687 45000 4,83 5,08 4,77 4,91 5 3 3 41% 15% 42% 2 98 212
Chaperonina GroEL (K04077) YP_001726800.1 57292 60899
60456 47803 4,85 4,93 4,08 4,61 3 3 2 33% 46% 16%
4 Fosfoglicerato quinase (EC 2.7.2.3) YP_001723783.1 41092 44083 5,08 5,45 3 66%
7 Proteína de ligação periplasmática (MglB) (K10540) YP_001724487.1 35705 33489 5,68 5,56 2 60%
12 Pirofosfatase inorgânica (EC 3.6.1.1) YP_001726716.1 19731 21962 5,03 5,34 4 59%
24
134 Triose-fosfato isomerase (EC 5.3.1.1) YP_001727024.1 26971 27899 28685 5,64 5,28 6.24 1 3 33% 60% 100
137 Malato desidrogenase (EC 1.1.1.37) YP_001723474.1 32327 34444 31041 5,61 6,25 5,64 3 5 55% 55% 124 Subunidade transportadora de D-ribose RbsB (K10439) YP_001727166.1 30938 28923 6,85 3,67 3 34% 133 Purina nucleosídeo fosforilase (EC 2.4.2.1) YP_001726610.1 25935 27976 5,42 5,98 3 25% 140 Diidrolipoamida acetiltransferase (EC 2.3.1.12) YP_001726485.1 66096 28950 5,09 9,13 4 27% 147
223
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, tipo I (EC 1.2.1.12) YP_001724829.1 35532 37398 37837 6,61 7,45 7,2 4 1 42% 37% 149
333 Aldolase frutose bifosfato (EC 4.1.2.13) YP_001723784.1 39122 40749 41916 5,52 6,17 6,23 4 3 40% 37%
173 Aldose 1-epimerase (EC 5.1.3.3) YP_001725860.1 38166 42188 4,84 4,9 2 60%
174 Fosfopiruvato hidratase (EC 4.2.1 .11) YP_001723929.1 45626 50300 5,32 5,88 3 43%
183
197 Fosfoenolpiruvato carboxiquinase (EC 4.1.1.49) YP_001723315.1 59643 63397 63275 5,46 5,77 5,9 3 2 38% 41%
195 Polinucleotídeo fosforilase (EC 2.7.7.8) YP_001723538.1 77036 65867 5,09 5,32 4 48%
213 219 330
Piruvato desidrogenase subunidade E1 (EC 1.2.4.1) YP_001726486.1 99597 40172 55535 56026 5,46 5,2 5,46 5,73 2 4 1 15% 28% 11% 232 Adenina fosforibosiltransferase (EC 2.4.2.7) YP_001726097.1 19858 27246 5,26 5,81 2 65% 238
351 Diidrolipoamida desidrogenase (EC 1.8.1.4) YP_001726484.1 50640 58844 57792 5,79 6,6 7,31 2 2 31% 15%
314 Fosfoglicerato mutase (EC 5.4.2.1) YP_001723109.1 56074 60138 5,18 5,5 2 22%
Tabela 2: Identificação das proteínas diferencialmente expressas em isolados de E. coli resistentes a magainina I, agrupadas por função. A identificação
proteica foi obtida através da combinação de PMF e sequenciamento de novo dos espectros MSMS.
ID Spot Proteína Identificada ID NCBI MM
Teórico MM Exper. pI Teór. pI Exper. Nº Pep. de novo % Seq. Metabolismo de Nitrogênio
101 L-asparaginase II (EC 3.5.1.1) YP_001723756.1 36812 36270 5,96 6,28 2 24%
207 Aspartato amônia-liase (EC 4.3.1.1) YP_001726804.1 52356 47016 5,19 5,45 4 60%
314 Glutamina sintetase (EC 6.3.1.2) YP_001727070.1 51870 60138 5,26 5,5 2 30%
361 Transportador de glutamato e aspartato, subunidade (K10001) YP_001725942.1 33340 32401 8,61 8,48 2 37%
160 Transportador ABC de glutamina (K10036) YP_001725787.1 27173 27361 8,44 7,63 3 49%
Metabolismo de Aminoácidos
179 Aminopeptidase B (EC 3.4.11.23) YP_001724148.1 46181 47650 5,49 6,12 2 11%
200 Aminoacil-histidina dipeptidase (EC 3.4.13.3) YP_001726292.1 52918 55896 5,3 5,87 2 41%
Resposta a Estresse
165 superóxido dismutase (EC 1.15.1.1) YP_001727034.1 23097 26277 6,44 7,33 4 52%
298 Catalase/peroxidase HPI (EC 1.11.1.6-7) YP_001726999.1 79861 35690 5,14 5,23 1 10%
187
335 Tioredoxina redutase (EC 1.8.1.9) YP_001725664.1 34601 36057 36145 5,3 5,74 6,03 3 3 41% 47%
257 Heat shock protein 90 (K04079) YP_001726093.1 71422 48108 5,09 5,24 2 11%
Outras Funções
107 Biossíntese de glicanos, proteina G (OpgG) (K03670) YP_001725509.1 57846 62161 6,7 7,2 2 51% 108 Proteína extracelular de ligação a soluto (K02035) YP_001725258.1 59979 56681 8,45 8,4 3 44%
193 Receptor putativo YP_001725172.1 38632 36979 9,3 9,03 4 61%
234 Fosfatase ácida/fosfotransferase (EC 3.1.3.2) YP_001726900.1 26101 27308 6,84 6,75 1 36%
239 Sulfatase (EC 3.1.6.1) YP_001725125.1 62688 61435 5,51 5,7 2 24%
258 Aldolase 2-dehidro-3-deoxifosfooctonato (EC 2.5.1.55) YP_001725372.1 30812 33768 6,32 7,31 2 17%
99 Peptidilprolil isomerase (EC 5.2.1.8) YP_001726145.1 48192 50418 4,83 4,4 3 32%
151 Fator de alongamento Tu (EC 3.6.5.3) YP_001726971.1 43313 38645 5,3 5,5 2 52%
161 Fator de alongamento G (EC 3.6.5.3) YP_001723378.1 77712 28685 5,24 7,33 3 26%
293 DNA topoisomerase I (EC 5.99.1.2) YP_001725316.1 97288 37727 8,68 8,39 1 17%
ID spot: número de identificação do spot; ID NCBI: número de identificação da proteína identificada no banco de dados NCBInr; MM (Da) Exper.: massa molecular experimental; pI Exper,: ponto isoelétrico experimental. Nº Pep. de novo: número de peptídeos sequenciados de novo; % Seq:. cobertura da Sequência obtida por sequenciamento, em porcentagem.
Na Tabela 2, as proteínas identificadas foram separadas por funções relacionadas e referenciadas pelas identificações do spot proteico e do banco de dados. A correspondência entre MM e pI teóricos e práticos foi apresentada, bem como o número de peptídeos trípticos de novo sequenciados e a cobertura da sequência por PMF. A maioria das proteínas identificadas tiveram pelo menos dois peptídeos trípticos sequenciados manualmente que combinaram com alguma sequência de E. coli ATCC 8739 (taxid:481805) depositada no NCBInr. A validação do processo de identificação proteica por sequenciamento de novo usado neste trabalho foi ilustrada na Figura 16.
sequenciamento de novo resultou em 3 sequências peptídicas equivalente a uma aldolase frutose-bifosfato depositada no banco de dados de proteínas NCBInr, restrito a proteínas de E. coli ATCC 8739. 2ª via: in silico PMF da proteína candidata (aldolase frutose-bifosfato) resultou em 20 massas de peptídeos, das quais 11 equivaleram ao padrão de PMF obtido da proteína do spot 149 por MS, resultando em uma cobertura de 40% da massa total da proteína candidata.
As sequências proteicas (Tabela 2) foram agrupadas de acordo com o principal processo metabólico em que elas estariam envolvidas. A porcentagem da distribuição de função é mostrada na Figura 17, destacando- se o metabolismo energético, o metabolismo de nitrogênio, o metabolismo de aminoácidos, a resposta a estresse e o espessamento da parede celular.
Figura 17: Distribuição funcional das proteínas diferencialmente expressas em isolados de E. coli
O maior grupo funcional contém as enzimas, reguladas positivamente, envolvidas na manutenção da energia célula (Figura 18), incluindo: 1) seis enzimas da via glicolítica: aldose 1-epimerase [YP_001725860], aldolase frutose bifosfato [YP_001723784], gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase [YP_001724829], fosfoglicerato quinase [YP_001723783], fosfoglicerato mutase [YP_001723109], e fosfopiruvato hidratase [YP_001723929]; 2) quatro enzimas envolvidas na formação de Acet il-CoA a partir do piruvato: piruvato desidrogenase subunidade E1 [YP_001726486], diidrolipoamida
desidrogenase [YP_001726484], e diidrolipoamida acetiltransferase
[YP_001726485]; 3) fosfoenolpiruvato carboxiquinase [YP_001723315], que reage com oxaloacetato para formar fosfoenolpiruvato; 4) pirofosfatase inorgânica [YP_001726716] relacionada à fosforilação oxidativa.
Ainda, proteínas relacionadas ao metabolismo de RNA também foram observadas (Figura 18). Na realidade, a degradação de RNA pode ser diretamente relacionada à produção de energia. Primeiramente, a maquinaria de degradação de RNA apresentou regu lação positiva nos isolados resistentes: a enzima glicolítica enolase ( fosfopiruvato hidratase [YP_001723929]) e a PNPase (polinucleotídeo fosforilase [YP_001723538]), ambas componentes do degradossomo de RNA tipo A, foram positivamente regulad as, favorecendo o mecanismo fosforolítico para degradação de RNA e recuperando energia na forma de NTP; duas proteínas associadas ao degradossomo também tiveram sua expressão gênica alterada nos isolados resistentes: chaperona molecular
DnaK [YP_001726580] e chaperonina GroEL [YP_001726800].
Concomitantemente, a regulação negativa dos transportadores ABC também parece ser relacionada à regulação glicolítica: MglB [YP_001724487] e a subunidade transportadora de D -ribose RbsB [YP_001727166], componente periplasmático de ligação à glicose/galactose e o sistema transportador de ribose, respectivamente.
Os isolados resistentes parecem melhorar o metabolism o heterotrófico (Figuras 19A e 19C), onde a principal fonte de captação de nitrogênio provém dos aminoácidos e proteínas . Em particular, a formação de L-Asp a partir de L-Asn foi controlada através da regulação negativa de L -asparaginase II [YP_001723756], enquanto o L -Asp remanescente foi convertido a fumarato e amônia, catalisado pela regulação positiva de aspartato amônia-liase [YP_001726804]. Em seguida, o nitrogênio foi assimilado através da regulação positiva de glutamina sintetase (GS) [YP_001727070], que catalisa a condensação de amônia e L-Glu para formar L-Gln. Ainda, os transportadores ABC dos aminoácidos glutamina [YP_0 01725787] e glutamato/aspartato [YP_001725942] foram regulados positivamente nos isolados resistentes (Figuras 19B e 19D). Os spots 179 e 200 representam enzimas que estão envolvidas principalmente no metabolismo de aminoácidos.