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Os parâmetros para a hidrólise de PG catalisada por PGA foram determinados em biorreator (método diferencial) e em reator (método das velocidades iniciais).

4.2.24.1

Em Reator (0,1 L) – Método das Velocidades Iniciais

Os parâmetros cinéticos para PGA livre e imobilizada foram determinados pelo método das velocidades iniciais utilizando 30 mL de caldo fermentativo livre de células e concentrações de PG variando de 1-40 g/L. As reações de hidrólise foram investigadas a 12 e 25 ºC e a atividade enzimática foi determinada pelo método PDAB. O reator com capacidade para 100 mL foi conectado a um banho termostático e um sistema com agitação mecânica foi utilizado.

4.2.24.2

Em Bioreator ( 2 L) – Método Diferencial ou Integral

Foi realizado um cultivo sob condições previamente estabelecidas, e após 48 h, quando a massa do fungo atingiu seu valor máximo, o biocatalisador (10 g/L) e penicilina (30 g/L) foram adicionados simultaneamente. Ao longo de 120 h amostras foram retiradas e as concentrações de PG e 6-APA foram determinadas usando o método enzimático.

4.2.25 Extração de 6-APA

4.2.25.1

Preparo de Adsorvente (Quitosana-Arginina)

Ativação de Quitosana I

Gel de quitosana foi preparado numa concentração de 40 g/L. Quitosana foi dissolvida em ácido acético 5% e mantida sob agitação por 2 h. Em seguida a solução de quitosana foi gotejada em uma solução de hidróxido de sódio 0,1 M e mantida sob agitação por 24 h.

A ativação de quitosana (pó ou gel) foi realizada adicionando-se 30 mL de glutaraldeído 0,5 M a 3 g de quitosana e mantendo a mistura sob agitação por 1 h a 25ºC. Em seguida

a quitosana foi filtrada a vácuo e adicionada a uma solução de arginina 1,5 M. Após 24 h, quitosana ativada foi reduzida com borohidreto de sódio.

Ativação de Quitosana II

Apesar do uso de glutaraldeído em excesso durante a ativação de quitosana descrita no item anterior, a presença de elevada concentração de grupos amino na quitosana pode promover o entrecruzamento do polímero, reduzindo assim a concentração de arginina em quitosana. Para evitar o entrecruzamento, prepararam-se soluções individuais equimolares de glutaraldeído e arginina. 1 mL da solução de glutaraldeído foi adicionado a 1 mL da solução de arginina e uma coloração amarela foi observada imediatamente, resultante da reação do aminoácido com o aldeído. Esta solução foi adicionada a 30 mL de uma suspensão de quitosana (3 g) em tampão bicarbonato 100 mM, pH 10, mantida sob agitação a 25 ºC. O procedimento foi repetido cada 30 minutos até que o sobrenadante da suspensão de quitosana apresentasse cor amarela constante, indicando o equilíbrio da reação entre o amino da quitosana e o aldeído do glutaraldeído-arginina. Após 24 h o gel foi filtrado e reduzido com borohidreto de sódio. Um esquema da estrutura química da quitosana ativada é apresentado na Figura 4.9.

4.2.25.2

Preparo de Adsorvente (Agarose-Arginina)

Agarose (CL 10%) foi previamente ativada com glicidol e etilenodiamino segundo metodologia desenvolvida por Fernandez-Lafuente et al, (1993). 3g do derivado obtido (agarose- glutaraldeído) foram mantidos em contato com 10 mL de solução de arginina 0,15 M (500 µmol de arginina/g gel) em tampão bicarbonato 100mM, pH 10 por 24 h. Em seguida o gel foi filtrado à vácuo e reduzido em solução 0,25 M de borohidreto de sódio pH 10 por 1h para converter o aldeído remanescente em hidroxilas inertes. Teste com o reagente de Schiff foi realizado para confirmar a redução dos aldeídos.

4.2.25.3

Tratamento das Resinas XAD-4, XAD-7 e XAD-761

Antes do uso, as resinas XAD foram submetidas a um pré-tratamento utilizando metanol, etanol e água destilada. 10 g da resina foram adicionadas a 20 mL de metanol e a mistura foi mantida sob agitação por 30 minutos. Em seguida a resina foi separada por filtração a vácuo, sendo o procedimento repetido por duas vezes. A resina tratada com metanol foi lavada com água destilada e seca em estufa a 50ºC por 24 h. Em seguida a resina passou por um processo de hidratação utilizando etanol e água. Um volume de 100 mL de etanol contendo a resina foi mantido em aitação até que não fossem observadas bolhas de ar no etanol, indicando que o volume interno das partículas dos adsorventes estava totalmente preenchido pelo solvente. Em seguida a resina foi lavada abundantemente com água destilada em sistema de filtração a vácuo.

4.2.25.4

Adsorção de 6-APA

Ensaios de adsorção de 6-APA foram conduzidos em água e em caldo fermentativo para investigar o efeito de competição entre 6-APA e componentes do caldo fermentativo. Soluções de 6-APA com concentração conhecida foram preparadas a pH 7,0 ou 3,6. Em seguida as soluções foram centrifugadas a 15.557 rcf por 10 minutos em centrífuga da Eppendorf , modelo 5810R, para remover quaisquer compostos precipitados nesses valores de pH. 0,3 g do adsorvente foram adicionados a 0,7 mL da solução de 6-APA por 1 h a 25 ºC, visto que este tempo foi suficiente para atingir o equilíbrio do sistema sem perda do 6-APA por degradação. Após 1 h, o adsorvente foi separado por filtração. A concentração de 6-APA, antes e após a adsorção foi determinada pelo método PDAB.

Foram utilizados como adsorventes as resinas comerciais XAD-4, XAD-7 e XAD-761, da Rohm & Haas Co. Gel de agarose CL (10%) da Amershan Bioscience Co (Uppsala/SU) e quitosana em pó (85% desacetilada) da Polymar Ind. Ltda foram modificadas quimicamente com o aminoácido arginina e usados como adsorventes.

4.2.26 Pré-Purificação 6-APA com Carvão Ativado e Etanol

A extração de 6-APA a partir de um meio complexo sofre vários tipos de interferência. Para minimizar o efeito destes interferentes foram realizadas etapas de pré- tratamento do caldo fermentativo.

Na primeira estratégia, 15 mL do caldo fermentativo foi mantido em contato com 1 g de carvão ativado, em seguida o carvão foi filtrado e o pH do caldo foi ajustado para 3,6 a fim de precipitar 6-APA no ponto isoelétrico e também mantido em contado com o suporte agarose-arginina para adsorção do 6-APA remanescente.

Na segunda estratégia, etanol foi adicionado ao caldo fermentativo e sua concentração variou de 0-80 % com o objetivo de forçar a precipitação de interferentes, como por exemplo, proteínas. O caldo foi filtrado para remoção de possíveis precipitados e o pH da solução foi ajustado para 3,6 e seguiu-se o procedimento de adsorção em 1 g de agarose- arginina.

4.2.27 Dessorção de 6-APA adsorvido em agarose-arginina

A dessorção de 6-APA foi investigada utilizando soluções de ácido clorídrico (pH 5,5; 4,5 e 3,5) e cloreto de sódio (1M). Adicionou-se 0,3g do adsorvente a 0,7 mL da solução dessorvente. Em seguida, o adsorvente foi filtrado e 6-APA em solução foi quantificado pelo método PDAB.