5.1.1.2.4.1 Seletividade na Adsorção de PGA
Os resultados apresentados nas tabelas 5.3 e 5.4 mostram que há maior redução da atividade específica no caldo fermentativo quando a adsorção foi feita em agarose- triptofano, entretanto, ainda se observa atividade enzimática no caldo fermentativo ao finaldo processo. Isso significa que nem toda PGA foi adsorvida. Considerando que a concentração de PGA é muito baixa em relação à concentração das demais proteínas presentes, ou seja, que a quantidade de PGA presente no caldo fermentativo não seria suficiente para saturar o suporte de afinidade nas condições de adsorção (aproximadamente 4 mg de proteínas totais por g de suporte) podemos afirmar que o suporte de afinidade também adsorve outras proteínas. Entretanto, a adsorção dessas outras proteínas é devida, provavelmente às interações hidrofóbicas, enquanto PGA deve interagir com o ligante também ou unicamente através de seu sítio ativo. Segundo Santarelli, (2000), a interação da PGA com moléculas hidrofóbicas pode ser classificada como pseudo-afinidade, pois a PGA interage com estes ligantes através de sua região hidrofóbica próxima ao sítio ativo (SANTARELLI et al., 2000).
Visando obtenção de dessorção seletiva de PGA foram utilizadas três soluções de eluição: solução de penicilina 40 g/L, solução etanol-água 30% v/v e solução de triptofano 40 g/L. O sobrenadante foi submetido a uma análise de eletroforese e os resultados são apresentados na Figura 5.6.
Figura 5.6: Eletroforese dos ensaios de dessorção em gel poliacrilamida 15% . Linha 1: B.S.A.; 2: Dessorção com solução de penicilina; 3: Dessorção com solução de triptofano; 4: Dessorção utilizando solução etanol-água.
Observou-se que somente a solução de triptofano foi eficiente para a dessorção de PGA (linha 3). A não dessorção com solução de penicilina G, substrato natural da enzima e que possui, portanto, afinidade maior que triptofano pela enzima, indica que a ligação de PGA ao suporte deve estar ocorrendo por dois mecanismos, o de afinidade e o de interações hidrofóbicas. Resultados semelhantes foram obtidos por outros pesquisadores que verificaram que soluções de efetores como penicilina G, penicilina V, ácido fenilacético e ácido 6- aminopeniclânico não foram eficientes para dessorção de PGA em suporte de afinidade e também atribuíram este fato à ocorrência de adsorção de PGA por interações hidrofóbicas (FITTON et al., 2001).
Não foi possível determinar o valor da atividade recuperada ao final do processo de purificação, visto que a enzima estava associada ao inibidor em solução. A retirada do inibidor constitui-se assim em nova etapa a ser estudada neste processo. Uma vez que a PGA será utilizada industrialmente na forma de enzima imobilizada, sendo que essa imobilização sempre ocorre na presença de inibidor para proteger o sítio ativo da enzima, a solução contendo PGA/triptofano poderá ser utilizada diretamente na imobilização. Após imobilização da enzima, lavagem com força iônica adequada poderá deslocar esse inibidor, tal qual ocorre com a tradicional imobilização usando ácido fenilacético como inibidor/protetor (GUISÁN, 1988).
As considerações acima conduziram a uma nova estratégia de purificação a ser investigada. Visto que parte das proteínas e pequenos peptídeos indesejados adsorvem no
suporte de afinidade, seria interessante usar uma condição de adsorção em que essas impurezas adsorvessem e PGA permanecesse em solução, o que seria possível ocupando-se o sítio ativo da enzima com outro inibidor para que ela não pudesse se ligar ao triptofano na superfície do suporte. A molécula selecionada deveria interagir com PGA e depois ser facilmente removida para que a máxima atividade fosse recuperada ao final do processo de purificação, o que sabidamente ocorre com ácido fenil acético durante o processo de imobilização de PGA.
5.1.1.2.4.2 Adsorção de PGA na Presença de Ácido Fenilacético
Para avaliar o efeito da presença de ácido fenilacético (AFA) na eficiência do processo de purificação de PGA, foi realizado um ensaio de adsorção nas condições previamente estabelecidas, adicionando AFA ao caldo fermentativo na concentração de 100 mM. Nesse ensaio a atividade enzimática foi determinada pela hidrólise de penicilina G utilizando o método desenvolvido por Balasingham et al., (1972). Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 5.5.
Tabela 5.5: Dados da atividade enzimática e concentração de proteína no sobrenadante de caldo fermentativo após adsorção em agarose-triptofano na presença de AFA a pH 9,0.
Amostra Atividade enzimática U PDAB/mL Concentração proteína (mg/mL) Atividade específica U PDAB/mg proteína Caldo fermentativo 0,268 0,300 0,893 Caldo fermentativo após adsorção 0,161 0,117 1,376
Estes resultados mostram que essa estratégia de adsorção reversa (PGA é mantida no sobrenadante enquanto as proteínas indesejadas são adsorvidas) teve sucesso, pois observamos aumento da atividade específica no caldo após adsorção em agarose-triptofano. Esse resultado nos animou a investigar outras variáveis que pudessem favorecer a adsorção de impurezas, mantendo PGA no sobrenadante com maior grau de pureza e valor de atividade recuperada. Foi investigado inicialmente o efeito do pH na adsorção das proteínas e a capacidade de adsorção do suporte.
5.1.1.2.4.3 Efeito do pH na Adsorção de Proteínas
Todos os experimentos anteriores foram realizados no pH do caldo fermentativo onde PGA foi produzida por B. megaterium (≅ 9,0). Para verificar o efeito do pH na adsorção de proteínas, testes de adsorção foram realizados a pH 5,0 na presença e na ausência de AFA. A Tabela 5.6 mostra a variação no fator de purificação em função do pH e presença de AFA.
Tabela 5.6: Resultados da adsorção de proteínas em agarose-triptofano a 15 ºC, por 60 min.
pH 5 pH 5
(AFA) pH 9
q*
(mg proteína/g adsorvente) 8,84 18,0 6,04
Atividade específica no sobrenadante
(U/mg de proteína) 7,17 5,81 2,87
Rendimento de adsorção
(% de proteína adsorvida) 46,1 76,0 22,6
Fator
de purificaçãoa 1,69 4,14 1,21
a O fator de purificação foi calculado dividindo-se a atividade específica (U/mg de proteína) medida
antes da purificação pela atividade específica medida após a purificação.
Uma análise mais detalhada do efeito do pH sobre a adsorção de proteínas é apresentada no gráfico da Figura 5.7.
Figura 5.7:Efeito do pH na adsorção de proteína presentes em caldo fermentativo. Adsorção por 4h a 4ºC em agitação orbital em gel agarose-triptofano na presença de AFA.
5 6 7 8 9 0 20 40 60 80 100
P ercentual de proteína adsorvida em função do pH Pr oteí na adso rvida ( % ) pH
A redução nos valores de pH do caldo fermentativo conduz a aumento significativo da quantidade de proteína adsorvida em agarose-triptofano até pH 5. Valores de pH menores que 5 não foram investigados devido à rápida inativação de PGA nestas condições.
A pH 5, por exemplo, as proteínas apresentam grupos superficiais carregados positiva e negativamente, o mesmo ocorre com o suporte. Isto faz com que interações eletrostáticas rapidamente sejam estabelecidas entre as proteínas e o suporte.
As proteínas presentes no caldo fermentativo apresentam ampla faixa de ponto isoelétrico (4,8 a 9,6) e diferentes tamanhos moleculares (14 a 50 kDa), sendo, portanto, difícil estabelecer uma condição ótima para purificação de PGA por adsorção das impurezas. Entretanto, uma adsorção eficiente das proteínas não necessariamente ocorre no ponto isoelétrico, pois arranjos espaciais favoráveis à adsorção podem ser obtidos em valores de pH diferentes do ponto isoelétrico (KEÇILI et al., 2006).
Neste trabalho foi estabelecido o pH 5 para purificação de PGA, visto que esta enzima apresenta boa estabilidade nesta condição e a eficiência de adsorção de proteínas é máxima. No estudo seguinte foi investigada a capacidade de adsorção do suporte.
5.1.1.2.4.4 Capacidade de Adsorção do Suporte
A capacidade de adsorção do suporte de afinidade e seu potencial de reutilização são informações importantes para sua aplicação em processos economicamente viáveis. Nesta etapa do trabalho, a capacidade de adsorção do suporte foi investigada e os resultados são apresentados na Figura 5.8.
Figura 5.8: Efeito do volume de caldo oferecido por grama de suporte na quantidade de proteína adsorvida a pH 9,0.
Observa-se que aproximadamente 5,5 mg de proteína são adsorvidas por grama de suporte, sem que ocorra saturação do suporte. Entretanto, foi observado que o percentual de proteína adsorvida varia de 67% quando se oferece 4 mL caldo/g suporte para 32% quando se oferece 120 mL. Ao aumentar o volume de caldo fermentativo 30 vezes, a quantidade de proteína adsorvida só aumenta 14 vezes, o que implica redução da atividade específica de PGA no sobrenadante após adsorção das impurezas. Neste trabalho, a razão utilizada nos diversos experimentos é de 20 mL caldo/g suporte.
A aparentemente baixa capacidade de adsorção pode ser explicada considerando a composição do caldo fermentativo (inúmeros íons orgânicos e inorgânicos e compostos hidrofóbicos) e a metodologia de quantificação de proteínas, método de Bradford, a qual só detecta proteínas com tamanho molecular maior que 5 kDa.
A pH 5 várias espécies encontram-se na forma ionizada. As espécies iônicas de menor peso molecular se difundem mais rápido e, portanto adsorvem preferencialmente. Entre as espécies iônicas de baixo peso molecular estão íons provenientes dos sais adicionados ao meio de cultivo, os aminoácidos livres e pequenos peptídeos. Estas moléculas não são detectadas pelo método de Bradford, entretanto a remoção destas impurezas pode ser confirmada pela variação da cor do caldo fermentativo durante a adsorção. Os aminoácidos, pequenos peptídeos e outros compostos que conferem cor ao caldo fermentativo (MORR, 1993) são removidos, e o caldo clarificado apresenta cor levemente amarela após adsorção,
Porcentagem de proteína adsorvida em função do volume caldo fermentativo oferecido
0 1 2 3 4 5 6 4 8 20 40 60 80 120
volume de caldo fermentativo(mL)/ g suporte
P ro teí n a a d so rvi d a (m g/ gs u por te )
enquanto o adsorvente torna-se consideravelmente escuro. A Figura 5.9 mostra fotos do caldo fermentativo (9a) antes e após a adsorção e do adsorvente (9b) antes e após a adsorção.
Figura 5.9: Caldo fermentativo e adsorvente antes e após adsorção de proteínas em agarose-triptofano. Adsorção em pH 5.6, 4 mL caldo fermentativo/ g adsorvente, 4 ºC.
5.1.1.2.4.5 Efeito da Temperatura na Adsorção de Proteínas (Na presença de AFA)
Para verificar o efeito da temperatura na quantidade de proteína adsorvida e atividade recuperada de PGA, foram realizados ensaios de adsorção em 5, 15 e 25 ºC, os resultados são apresentados na Tabela 5.7.
Tabela 5.7:Resultados da adsorção de proteínas em agarose-triptofano a 15 ºC, por 60 min.
Temperatura (°C) Atividade específica no sobrenadante (U/mg proteína)
5 11,0 15 50,8 25 26,2
Verificou-se que a quantidade de proteína que permanesce no sobrenadante após a adsorção não varia significativamente com a temperatura (~ 0,08 mg/mL), entretanto, observa-se significante redução da atividade específica no sobrenadante com a diminuição da temperatura de 25 para 5 °C. Aparentemente, a menor temperatura favorece a adsorção de PGA. Para verificar se uma temperatura intermediária permitiria maior recuperação da atividade enzimática no sobrenadante realizou-se o experimento a 15 ºC, obtendo-se uma atividade específica de 50,8 U/mg. Considerando-se que a atividade específica inicial no caldo fermentativo foi de 11,2 U/mg, esses resultados mostram que um fator de purificação de 4,5 foi atingido. Esse resultado é melhor que o relatado na literatura, quando triptofano foi utilizado como grupo de afinidade, no qual foi obtido um fator de purificação de 3 vezes (FITTON et al., 2001).