Konkurranseforholdene i overnattingsbransjen

Duas estratégias de imobilização foram investigadas neste trabalho. A primeira consistiu em imobilizar a PGA diretamente sobre esferas de 4 mm de diâmetro, enquanto na segunda estratégia a PGA era imobilizada em partículas de 400 µm e em seguida essas partículas eram dispersas em solução de agarose e gotejadas em vaselina para formação das esferas de 4 mm. Em ambas as estratégias, limalha de aço inoxidável era adicionada à solução de agarose, com o objetivo de magnetizar as esferas e facilitar sua separação ao final do cultivo.

A Figura 5.35 mostra uma foto das esferas de agarose magnetizada, suspensas com a ajuda de um imã.

Figura 5.35 PGA imobilizada dispersa em agarose dissolvida a 85 ºC contendo partículas magnéticas.

5.2.2.1 Imobilização Direta de PGA Sobre Esferas de Agarose

A imobilização direta da PGA em esfera de agarose foi realizada mantendo uma solução da enzima em contato com as esferas previamente ativadas. O sistema foi mantido sob agitação mecânica por 24h. Um teste qualitativo usando reagente de Bradford foi realizado para verificar a dispersão da enzima na esfera. A coloração azul indica a presença de proteínas. O teste foi realizado mantendo a esfera sob agitação por 10 minutos no reagente citado.

Ao fim de 10 minutos foi realizado um corte transversal na esfera e observou- se que a imobilização ocorreu somente na superfície da esfera, como mostra a Figura 5.36.

Figura 5.36: Esferas de agarose contendo PGA imobilizada. (a) gel de agarose; (b) gel de agarose contendo partícula magnética imobilizada.

Uma hipótese para o fenômeno observado é que, na condição de imobilização utilizada neste trabalho (pH 10), a primeira ligação da enzima ao suporte ocorre muito rapidamente. Portanto, muitas proteínas podem ser ligadas na entrada do poro, impedindo a

entrada de uma maior carga enzimática. Esta hipótese é reforçada pelo fato de que a concentração de agarose neste gel é muito elevada (10 % m/v).

Quanto maior a concentração de agarose, menor é o diâmetro de poros no gel preparado. Por outro lado, com o aumento da concentração de agarose também ocorre um aumento no diâmetro da fibra que constitui a rede polimérica, aumentando assim a superfície disponível para formar ligações multipontuais e consequentemente aumentando a estabilidade do derivado imobilizado.

Para verificar esta hipótese, preparou-se uma solução da enzima a pH 7 (neste pH não ocorre ligação da enzima ao suporte) e manteve-se esta em contato com esferas ativadas sob agitação por 12 h. Em seguida o pH deste sistema foi ajustado em 10 pela adição de carbonato de sódio e novamente foi submetido a agitação por mais 12 h. Este procedimento foi realizado com o objetivo de promover primeiramente a difusão das proteínas para o centro da esfera (pH 7) e em seguida forçar a ligação destas ao suporte (pH 10).

Os resultados obtidos reproduziram o fenômeno observado na Figura 4.38, ou seja, não houve difusão de proteínas no interior da esfera de agarose. Supõe-se então que a concentração de agarose 10% m/v não permitisse a imobilização de PGA em toda a extensão de uma esfera com diâmetro de 4mm.

Para solucionar este problema foram preparadas esferas com menor concentração de agarose. Soluções de 8, 6, 4 e 2 % p/v foram preparadas e as respectivas esferas foram ativadas e submetidas à imobilização. Surpreendentemente, o mesmo fenômeno foi observado.

Concluiu-se que, para partícula de agarose com 4 mm de diâmetro, a imobilização direta de uma enzima relativamente grande (90 kDa) é inviável. Entretanto, estes resultados não podem ser atribuídos somente ao elevado diâmetro da partícula, visto que este fenômeno também foi observado em partículas de 1 mm. Acredita-se que o brusco resfriamento da solução de agarose pode gerar uma rede com baixo grau de organização, o que dificulta o transporte de macromoléculas através da esfera.

Outra estratégia proposta foi dispersar a PGA livre na solução de agarose, gotejar esta solução em vaselina para formar as esferas. Em seguida, seria promovida a ligação covalente da enzima às fibras de agarose, entretanto se o pó de agarose fosse previamente ativado com glicidol não seria possível dissolvê-lo e formar as esferas. Também não seria possível ativar a agarose na presença da enzima, visto que o pH de ativação é muito elevado (NaOH 0,75 M), pois isto inativaria a enzima, portanto esta estratégia foi descartada.

5.2.2.2 Dispersão de Partículas Contendo PGA em Esferas de Agarose

A necessidade de um biocatalisador com elevada carga enzimática e estabilidade operacional levou à busca de novas estratégias de preparo deste. Um método bem estabelecido de imobilização de PGA sobre partículas de gel de agarose comercial com 400 µm foi utilizado. A grande vantagem de utilizar partículas deste gel comercial é a garantia de um material de elevada qualidade, preparado com controle de temperatura de alta precisão e condição de entrecruzamento que garantem a máxima uniformidade na distribuição do tamanho de poro e estabilidade da partícula.

As pequenas partículas contendo PGA imobilizada (pelo método descrito no item 3.2.14.1) e estabilizada (termicamente, 8.000 vezes em relação à enzima livre) foram dispersas em solução aquosa de agarose previamente dissolvida a 85 ºC e resfriada até 60 ºC para receber a enzima sem causar inativação da mesma. A mistura das partículas e seu gotejamento em vaselina foram realizados em poucos segundos, para garantir que nenhuma perda de atividade catalítica ocorresse durante o preparo das esferas.

O biocatalisador obtido desta maneira pode ser visualizado na Figura 5.37.

Figura 5.37: Teste da dispersão de enzima em esferas de agarose (1) Esfera controle – sem a enzima e tratada com reagente de Bradford; (2) Esfera contendo partículas de PGA corada com Bradford; (3) Corte transversal de (2); (4) Corte de esfera de agarose com imobilização direta de PGA; (5) Aglomerado de partículas de gel de agarose com 400 µm contendo PGA imobilizado e corado com reagente de Bradford.

A dispersão de partículas contendo PGA imobilizada em esferas de agarose resultou numa melhor distribuição da enzima em todo o volume da esfera. Apesar de obter atividade aparente similar às esferas contendo PGA imobilizada diretamente (Tabela 5.9) sua atividade específica (U/ g do biocatalisador) é superior.

A atividade teórica para o método de imobilização direto é calculada com base na atividade que desaparece do sobrenadante durante o processo de imobilização. Sabendo-se que a enzima está imobilizada somente na superfície da esfera, os efeitos difusivos podem ser

considerados desprezíveis e a atividade aparente medida é aproximadamente igual à atividade real do derivado. Neste caso, a baixa atividade catalítica pode ser atribuída à etapa de redução com borohidreto de sódio, a qual é realizada após a medida da atividade final do sobrenadante. Portanto, parte da atividade teórica do derivado é perdida pela ação do borohidreto, e a atividade medida no derivado é inferior à teórica.

Tabela 5.9: Comparação de biocatalisadores preparados por diferentes estratégias

Método de Imobilização Atividade teórica (UI/g)a Atividade aparenteb (UI/g)

Direto 130,4 23,77 ± 2,7

Por dispersão de partículas 100,0 15,50 ± 3,1

a

Atividade enzimática (de PGA imobilizada em partículas de 400 µm) dispersada por grama das esferas de 4 mm de diâmetro.

b _{Atividade medida diretamente nas esferas de 4 mm de diâmetro.}

Por outro lado a baixa atividade aparente no biocatalisador obtido por dispersão pode ser atribuída a efeitos difusivos. Neste método, a atividade teórica é medida nas partículas pequenas depois que a enzima já está imobilizada e estabilizada e a dispersão destas na esfera de 4 mm é um método físico, ou seja, não é capaz de causar perda de atividade catalítica da PGA. Considerando as possíveis atividades reais finais nas esferas de agarose, pode-se afirmar que o biocatalisador obtido por dispersão tem uma carga enzimática quase 5 vezes maior que o biocatalisador obtido por imobilização direta da PGA.

Biocatalisadores com maior atividade catalítica ainda podem ser obtidos utilizando PGA com maior grau de pureza para imobilização em partículas de 400 µm, pois a partir de extratos brutos a atividade máxima obtida foi 500 UI/g, isso ocorre porque proteínas indesejáveis competem com a PGA por sítios de ligação do suporte. Além disso, pode-se aumentar a concentração de partículas de agarose de 400 µm na solução de agarose. Neste trabalho, foram utilizados 0,2 g de partículas para 0,8 g da solução de agarose 8 % m/v, ou seja, a atividade das partículas foi diluída 5 vezes e obteve-se um biocatalisador com atividade teórica final de 100 UI/g.

Para os objetivos deste trabalho, a atividade enzimática obtida foi satisfatória, além disso, a quantidade de atividade enzimática e a estabilidade mecânica da esfera de 4 mm é uma solução compromisso. À medida que aumenta o número de partículas na solução de agarose, a estabilidade mecânica é reduzida, pois a interação entre as cadeias poliméricas é dificultada devido à presença de interferentes, e a esfera torna-se mais “quebradiça”.