Regnskapets kvalitetskrav

Os extratos totais foram analisados em gel SDS-Page 12%, conforme descrito no item 4.16 (resultados não mostrados). Não foi possível observar uma banda referente à proteína expressa (rLc36) entre as proteínas totais, uma vez que diferentes proteínas, com pesos moleculares similares, podem estar sobrepostas no gel, dificultando a visualização da expressão das proteínas de interesse. Na tentativa de observar as bandas de expressão, decidiu-se realizar a expressão em grande escala e utilizando outras linhagens bacterianas, que foi realizada de acordo com o item 4.17.

5.7.4 Purificação das proteínas recombinantes

Os resultados da indução e purificação em grande escala demonstraram a linhagem BL21 (DE3) expressou a proteína rL36, como é possível observar na figura 17. Nos demais testes de expressão, não foram observadas as proteínas recombinantes de interesse (dados não mostrados).

Figura 17 – Análise da expressão das proteínas recombinantes rLc24 e rLc36 em diferentes linhagens de E. coli à temperatura de 30ºC.

SDS-Page 12%, corado com Coomassie blue. Extrato de células E. Coli BL21 (DE3) pET28aLc_36. T0: não induzido; T4: 4 horas de indução; FT: flowthrought; lavagem da coluna de níquel com as soluções de 20 mM de imidazol, 40 mM de imidazol, 80 mM de imidazol e 200 mM de imidazol. PM: Peso molecular de massa de proteínas (Kaleidoscope Prestained Standards – Bio-rad). As setas em vermelho indicam a localização da proteína induzida. Fonte: do autor.

5.8 WESTERN BLOT

A figura 18 confirma a presença da cauda de poli-histidina nas proteínas, confirmando sua identidade e mostra que a proteína rLc36 esta presente em grande quantidade nas frações solúvel e insolúvel da amostra purificada. Como a proteína rLc36 está presente em quantidade significativa na fração solúvel, apesar da maior porção estar na fração insolúvel, foi possível iniciar os testes de antigenicidade com a mesma.

Figura 18 – Western blot da proteína recombinante rLc36.

Produto de indução purificado e processado de E. coli BL21 (DE3) pET28aLc_36, indução a 30o_C,

(FS) fração solúvel e (FI) fração insolúvel. Lavagem da coluna de níquel com as soluções de 200 mM de imidazol; 80 mM de imidazol; 40 mM de imidazol; 20 mM de imidazol. P: pellet da purificação ou fase insolúvel (FI). PM: Peso molecular de massa de proteínas (Kaleidoscope Prestained Standards – Bio-rad). As setas em vermelho indicam a localização da proteína induzida Fonte: do autor.

5.9 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) COM A PROTEÍNA rLc36 PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgG ANTI-LEISHMANIA

Foram testadas diferentes concentrações de antígeno (0,5µg/mL; 1,0µg/mL; 2,0µg/mL; 2,5µg/mL; 5,0µg/mL e 7,5µg/mL) e diferentes diluições de soros (1/100, 1/200, 1/400 e 1/800) para ensaios preliminares, a fim de avaliar o potencial antigênico da proteína rLc36. Utilizaram-se dois soros caninos positivos e dois soros caninos negativos para leishmaniose visceral.

Os resultados obtidos nesse teste preliminar revelaram que houve um aumento gradual da reatividade (absorbância) com o aumento das variáveis “concentrações de antígeno” e “diluição de soro” e que a melhor reatividade com os soros testados foi obtida na

78kDa 45,7kDa 32,5kDa 18,4kDa 7,6kDa 28,4kDa FS FI 200 80 40 20 P PM mM mM mM mM

concentração de 7,5µg/mL de antígeno e na diluição de 1/200 de soros; neste caso, observa-se uma diferença maior na leitura de absrovância entre os soros negativos e positivos, como demonstrado na tabela 5 e na figura 19.

Nos resultados apresentados e discutidos a seguir, todos os soros precedidos da letra N e em azul são soros negativos para leishmaniose visceral canina e os precedidos da letra P e em vermelho são positivos para a enfermidade; os números utilizados foram apenas para facilitar a organização das amostras.

Tabela 5 – Absrovância dos soros positivos e negativos utilizados no ensaio preliminar de ELISA com as variáveis de concentração de antígeno, diluição dos soros e tempo de incubação da reação.

30 minutos 45 minutos 60 minutos

Soro (diluição) Soro (diluição) Soro (diluição)

rLc36.0 (0,5ug/mL) 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 N16 0,217 0,249 0,261 0,369 0,274 0,302 0,337 0,472 0,29 0,328 0,363 0,535 N22 0,22 0,25 0,28 0,434 0,242 0,279 0,325 0,594 0,264 0,307 0,366 0,757 P518 0,167 0,221 0,256 0,308 0,179 0,253 0,306 0,376 0,469 0,339 0,304 0,19 P520 0,134 0,127 0,147 0,189 0,151 0,144 0,164 0,22 0,258 0,173 0,154 0,157 rLc36.0 (1,0ug/mL) 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 N16 0,21 0,255 0,283 0,31 0,257 0,337 0,359 0,416 0,264 0,36 0,399 0,449 N22 0,229 0,251 0,287 0,384 0,256 0,296 0,344 0,471 0,274 0,372 0,391 0,566 P518 0,207 0,263 0,295 0,389 0,228 0,316 0,366 0,472 0,249 0,363 0,442 0,564 P520 0,122 0,142 0,165 0,167 0,131 0,162 0,192 0,194 0,142 0,171 0,209 0,217 rLc36.0 (2,0ug/mL) 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 N16 0,099 0,265 0,312 0,343 0,128 0,387 0,386 0,451 0,124 0,41 0,434 0,531 N22 0,183 0,25 0,283 0,43 0,215 0,29 0,344 0,539 0,202 0,306 0,395 0,665 P518 0,165 0,263 0,307 0,52 0,193 0,336 0,42 0,671 0,187 0,388 0,499 0,856 P520 0,113 0,122 0,128 0,21 0,136 0,153 0,152 0,25 0,135 0,161 0,169 0,297 rLc36.0 (2,5ug/mL) 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 N16 0,148 0,18 0,253 0,319 0,166 0,217 0,29 0,371 0,176 0,251 0,322 0,467 N22 0,135 0,159 0,205 0,369 0,151 0,187 0,244 0,503 0,179 0,235 0,3 0,653 P518 0,191 0,345 0,371 0,523 0,222 0,419 0,46 0,641 0,264 0,533 0,603 0,854 P520 0,142 0,134 0,146 0,209 0,169 0,151 0,169 0,266 0,181 0,173 0,182 0,309 rLc36.0 (5,0ug/mL) 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 N16 0,155 0,22 0,271 0,344 0,179 0,261 0,336 0,438 0,194 0,29 0,402 0,53 N22 0,138 0,222 0,221 0,333 0,156 0,258 0,293 0,423 0,194 0,303 0,367 0,533 P518 0,279 0,427 0,511 0,693 0,383 0,544 0,676 0,892 0,451 0,673 0,819 1,15 P520 0,121 0,156 0,184 0,24 0,148 0,175 0,224 0,291 0,158 0,193 0,261 0,343 rLc36.0 (7,5ug/mL) 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 1/800 1/400 1/200 1/100 N16 0,157 0,178 0,24 0,458 0,187 0,229 0,32 0,581 0,195 0,257 0,379 0,731 N22 0,117 0,167 0,188 0,441 0,138 0,208 0,245 0,579 0,157 0,233 0,299 0,742 P518 0,247 0,366 0,738 0,978 0,347 0,53 0,964 1,321 0,428 0,679 1,241 1,691 P520 0,109 0,156 0,217 0,346 0,12 0,185 0,272 0,455 0,128 0,211 0,333 0,555

Soros em azul são negativos (N) para leishmaniose visceral canina, enquanto os soros em vermelho são positivos (P) para a enfermidade. Fonte: do autor.

Figura 19 – Gráficos do quadrante E9-H12: 7,5µg/mL de antígeno por poço nos tempos de incubação 30, 45 e 60 minutos.

Abscissas: concentração de soros 1/800, 1/400, 1/200 e 1/100. Ordenadas: absrovância das amostras

em comprimento de onda 405nm. N16 e N22: soros caninos negativos para leishmaniose visceral. P518 e P520: soros caninos positivos para leishmaniose visceral. Fonte: do autor.

Considerando-se, ainda, a variável “tempo de incubação”, os resultados obtidos em 30, 45 e 60 minutos de incubação mostram um aumento da absrovância de forma proporcional para cada ponto do gráfico; dessa forma, uma incubação mais longa (60 minutos), não prejudica o ensaio, e pelo contrário, melhora a observação dos resultados.

É possível observar na figura 19 que o soro positivo P520 permaneceu na linha dos soros negativos (N16 e N22) durante todo o experimento. Uma possível explicação para este comportamento observado pode ser o fato de cada organismo responder imunologicamente de forma diferente ao antígeno (parasito) e/ ou, dependendo do estágio da doença, apresentar resposta imunológica humoral diferenciada de acordo com os antígenos expressos em cada fase da doença.

Em busca de resultados mais concretos, a partir dos dados obtidos, mais soros foram testados na região em que a antigenicidade da proteína rLc36 foi observada com maior relevância (7,5µg/mL de rLc36 e soro 1/200). Dessa maneira os testes seguintes foram realizados apenas nessa diluição.

Levando-se em consideração que os melhores resultados foram obtidos na concentração de 7,5µg/mL de proteína, novo teste foi realizado, utilizando a concentração de 10,0µg/mL; o objetivo deste aumento era observar se quantidades maiores de proteína melhorariam a diferença de absrovância entre os valores negativos e positivos. Desta forma, utilizou-se 10 soros positivos e 10 soros negativos. Como controle, foram preparados 2 poços sem antígenos e sem soros para reações com o conjugado. Além disso, calculou-se o cut off ou ponto de corte (ponto determinado estatisticamente que caracteriza valores acima como positivos e valores iguais ou abaixo como negativos) conforme descrito em Frey, Di Canzio e Zurakowski, 1998, considerando-se uma confiança de 95%.

Nesse novo ensaio, obtiveram-se resultados mais satisfatórios com a concentração de 10,0µg/mL quando comparado à concentração de 7,5µg/mL. Os resultados estão expostos na tabela 6 e na figura 20.

Tabela 6 – Absrovância dos soros positivos e negativos em diluição de 1/200 utilizados no segundo ensaio de ELISA para concentração 7,5µg/mL de 10µg/mL de antígeno rL36, com 60 minutos de incubação.

Soros Absorbância* (7,5µg/mL) Absorbância* (10µg/mL)

P518 1,397 1,435 P508 0,386 0,476 P509 0,277 0,269 P510 3,209 2,78 P512 0,217 0,251 P515 0,335 0,335 P71 0,437 0,544 P519 0,227 0,259 P76 0,434 0,624 P82 1,068 1,321 N2 0,05 0,081 N5 0,125 0,146 N7 0,176 0,139 N11 0,079 0,108 N17 0,145 0,147 N19 0,104 0,105 N21 0,168 0,170 N23 0,103 0,114 N26 0,015 0,048 N30 0,144 0,102 BR1 0,117 - BR2 0,138 -

Cut off (95% confiança) 0,185 -

*Absrovância em 405nm subtraída da média dos brancos. Soros em azul são negativos (N) para leishmaniose visceral canina, enquanto os soros em vermelho são positivos (P) para a enfermidade. Fonte: do autor.

Figura 20 – Reatividade dos soros positivos e negativos para LVC testados na diluição de 1/200 perante a concentração de 10µg/mL da proteína rLc36, com 60 minutos de incubação.

Os pontos vermelhos correspondem aos soros positivos enquanto os azuis aos soros negativos. A linha verde na horizontal representa o valor do cut off para 95,0% de confiança (Frey, Di Canzio e Zurakowski, 1998) e cujo valor corresponde a 0,185. Fonte: do autor.

Mais soros foram testados (considerando os soros testados anteriormente) totalizando 22 soros positivos e 22 soros negativos para cálculos preliminares de sensibilidade e especificidade. Os resultados estão expostos nas tabelas 7 e 8 e na figura 21.

Tabela 7 – Absrovância dos soros positivos e negativos em diluição de 1/200 para concentração de 10µg/mL de antígeno rL36, com 60 minutos de incubação para cálculo de sensibilidade e especificidade adicionado dos dados da tabela 9 para a mesma concentração.

Soros Absorbância* (10µg/mL) Soros Absorbância* (10µg/mL)

P518 1,435 N16 0,161 P520 0,243 N22 0,289 P501 0,066 N1 0,501 P503 0,106 N2 0,081 P504 0,146 N3 0,268 P508 0,476 N5 0,146 P509 0,268 N7 0,139 P510 2,78 N8 -0,027 P511 0,198 N9 0,271 P512 0,251 N10 0,108 P513 0,175 N17 0,147 P514 0,219 N18 0,294 P515 0,335 N19 0,105 P516 -0,026 N21 0,17 P517 0,126 N23 0,114 P71 0,544 N26 0,048 P519 0,259 N27 0,26 P76 0,624 N29 0,156 P521 0,142 N30 0,102 P522 0,187 N32 0,207 P82 1,273 N33 -0,02 P135 0,186 N34 0,899 BR1 0,117 - - BR2 0,138 - - Cut off (95% confiança) 0,185 - -

*Absrovância em 405nm subtraída da média dos brancos. Soros em azul são negativos (N) para leishmaniose visceral canina, enquanto os soros em vermelho são positivos (P) para a enfermidade. Fonte: do autor.

Figura 21 – Reatividade dos soros positivos e negativos para LVC testados para cálculo de sensibilidade e especificidade na diluição de 1/200 perante a concentração de 10µg/mL da proteína rLc36, com 60 minutos de incubação.

Gráfico construído com os dados da tabela 10. Os pontos vermelhos correspondem aos soros positivos enquanto os azuis aos soros negativos. A linha verde na horizontal representa o valor do cut off para 95,0% de confiança (Frey, Di Canzio e Zurakowski, 1998) e cujo valor corresponde a 0,185. Fonte: do autor.

Tabela 8 – Resultado inicial de sensibilidade e especificidade da proteína rLc36 em ensaio de ELISA.

Fórmula Resultado

Sensibilidade S = VN/ (VN+FP) 64%

Especificidade E= VP/ (VP+FN) 60%

Fonte: do autor.

Pôde-se observar que os valores encontrados para sensibilidade e especificidade nestes testes preliminares mostraram-se promissores; e, considerando a pequena quantidade de soros testados, serão necessários mais dados experimentais para confirmar a veracidade e relevância dos resultados a ponto de afirmar o quanto o antígeno avaliado nesse método é

capaz de identificar os verdadeiros positivos (sensibilidade) e diferenciar os verdadeiros positivos de verdadeiros negativos (especificidade).