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Resumo – Na Região de Trás-os-Montes (nordeste de Portugal) a cultura do castanheiro, Castanea sativa Mill. é extremamente importante. A maior percentagem da perda de produção ocorre devido à doença da tinta do castanheiro, cujo agente causal é o oomiceta Phytophthora cinnamomi. Este oomiceta é também responsável pelo declínio de muitas outras espécies de vegetais no mundo.Grande parte das espécies de Phytophthora estudadas segrega elicitinas, proteínas que podem induzir uma reação hipersensível (HR) e provocar resistência sistémica adquirida (SAR) em algumas espécies de plantas, que resulta na aquisição de imunidade, por parte do hospedeiro, contra uma variedade de agentes patogénicos. Proteínas envolvidas no mecanismo de infeção por

P. cinnamomi foram identificadas pelo nosso grupo, no âmbito dos projetos Identificação, caracterização e papel de factores moleculares associados ao mecanismo de infeção de espécies de Fagaceae por Phytophthora

cinnamomi, PTDC/AGR-AAM/67628/2006, financiado pela FCT; Combate à doença da tinta do castanheiro e outras culturas regionais por métodos moleculares, COMBATINTA/SP2.P11/02 - Interreg IIIA, financiado pelo FEDER. As proteínas referidas são: endo-1,3-beta-glucanase e exo-glucanase, responsáveis pela adesão, penetração e colonização do tecido hospedeiro; proteína inibidora de glucanases (GIP), responsável pela supressão das respostas de defesa do hospedeiro; proteína 1 indutora de necrose de Phytophthora (NPP1) e transglutaminase que induz respostas de defesa e de sintomas de doença. Estudos de RT-PCR demonstram que as elicitinas de P. cinnamomi têm maior expressão em substratos tais como celulose e serrim de castanheiro. Os estudos de expressão destes genes na infeção in vivo, com linhas de células de Castanea sativa, revelam íntima relação entre a planta e o agente fito-patogénico que tem levado a coevolução de uma série de complexas estratégias de ataque e defesa. Para um agente patogénico colonizar um hospedeiro com êxito, ele deve desenvolver mecanismos quer para escapar à deteção ou, na falta deste, para subverter as respostas de defesa. Palavras-chave: Phytophthora cinnamomi, Castanea sativa, RT-PCR, elicitinas.

1 Introdução

A classe dos oomycetas forma uma das várias linhagens dentro do Reino Chromista que, evoluíram para um estilo de vida parasitária e, consequentemente, desenvolveram mecanismos alternativos de patogenicidade. Os oomycetas compartilham com muitos agentes patogénicos de plantas a exigência de um tecido vivo no hospedeiro, pelo menos, em parte do ciclo de infeção. Para estabelecer a infeção, esses agentes patogénicos devem fugir, suprimir ou manipular as defesas do hospedeiro. Devido às suas particulares características fisiológicas, não existem tratamentos eficazes contra doenças causadas por estes microrganismos. Para desenvolver tratamentos, contra Phytophthora, parece essencial compreender os mecanismos moleculares que determinam a interação entre as espécies de Phytophthora e as plantas hospedeiras.

Phytophthora cinnamomi Rands é um agente, destrutivo pertencente á classe dos oomycetas que infecta plantas hospedeiras, incluindo muitas florestais, ornamentais e frutíferas. Por exemplo, a doença da “tinta” de Castanea

sativa Mill, uma das doenças mais devastadoras em C. sativa é causada por este oomiceta. Os sintomas mais comuns são a necrose com consequente redução no crescimento das raízes o que invariavelmente leva à morte das árvores.

P. cinnamomi, cujo ciclo de vida se desenvolve integralmente no solo, requer condições de solo húmidas e temperaturas quentes para ser ativo, mas os danos visíveis causados pela doença ocorrem com mais frequência no verão, quando as plantas estão numa situação de secura. Este agente patogénico pode crescer de forma saprófita no solo e persistir no solo ou em material vegetal infetado como clamidporos e, em menor extensão, como oósporos. É conhecida pela sua capacidade de sobreviver durante mais de 6 anos em solo húmido, e é

claro que a humidade é um fator essencial para o estabelecimento de propagação, e longevidade deste agente patogénico [1].

As técnicas de identificação e diagnóstico para P. cinnamomi requerem atenção de especialistas. Medidas preventivas de aplicação de produtos químicos são as formas típicas de controlo para este agente patogénico. Não há métodos de erradicação disponíveis.

Figura 1. Culturas de Phytophthora cinnamomi em meio PDA.

Vários eventos celulares, tais como aderência à superfície do anfitrião, penetração e colonização do tecido hospedeiro, acontecem durante a infeção de plantas por oomycetas que também podem manipular processos bioquímicos e fisiológicos nas plantas hospedeiras através de um conjunto diversificado de moléculas, conhecidas como efetores [2, 3]. Em plantas suscetíveis, essas efetores podem promover a infeção por supressão de respostas de defesa, aumentando a suscetibilidade e os sintomas de doença. Nas plantas resistentes, a resposta de defesa eficaz conhecida como a resposta de hipersensibilidade (HR) restringe o agente patogénico a uma área definida [3-5]. Os efetores de Phytophthora que suprimem as respostas de defesa do hospedeiro foram descritos em vários patossistemas. A supressão das defesas do hospedeiro pode ocorrer através da produção de proteínas inibidoras de enzimas alvo.

As primeiras observações de que as plantas secretam proteínas inibidoras que se ligam e inativam hidrolases microbianas, especificamente a ligação de proteínas vegetais inibidores de poligalacturonase (PGIPs) para poligalacturonases fúngicas, estimularam a procura de proteínas inibidoras análogas de micróbios que podem inativar β (1,3) endoglucanases e quitinases da plantas hospedeiras [6]. Por exemplo a proteína inibidora de Glucanases (GIP), funciona como molécula defensiva que inibe a degradação de β (1,3) e (1,6) glucanos da parede celular do agente patogénico [5].

Os agentes patogénicos secretam endo-β -1,4-glucanases, que hidrolisam uma gama de glucanos da parede celular das plantas. Os elicitores de β -1,3 -, β -1,6-glucano que são libertados durante o processo são percebidos pela planta, através de um recetor ligado à membrana e inicia-se uma cascata de sinalização que resulta no aumento da regulação de um conjunto de defesas da planta. Depois de identificadas as PGI’s os estudos têm-se focado na sua caracterização bioquímica, dirigindo-se a características, tais como as propriedades de ligação e especificidade do ligando. A observação de que as proteínas se ligam fortemente às enzimas que degradam polissacarídeos da parede celular, em conjunto com vários conjuntos de dados de expressão, sugere que elas são suscetíveis de influenciar as interações planta- agente patogénico. No entanto, o seu significado biológico não foi ainda estabelecido. Muitas questões permanecem igualmente ao nível molecular, tais como a identidade dos domínios e resíduos chave dos inibidores de proteínas que contribuem para a especificidade de reconhecimento e ligação.

Na nossa investigação identificamos genes envolvidos na resposta de defesa do castanheiro contra o stress biótico causado por P. cinnamomi e elucidamos a função desses efetores moleculares: GIP - proteína inibidora de glucanases ; NPPI - proteína indutora de necrosis em Phytophthora; beta(1,3) - endo-glucanase - adesão,

penetração e colonização do tecido hospedeiro; TRANSGLUTAMINASE - codifica proteínas envolvidas na indução de respostas defensivas e sintomas da doença e identificamos, sequenciamos e caracterizamos os genes estruturais actina e tubulina de P. cinnamomi.