Prognoser, prissetting og informasjon til

Os iniciadores de PPV, desenhados neste trabalho, ao serem submetidos à análise de

especificidade in silico utilizando os

programas Primer Blast e Blast (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) demonstraram uma amplificação somente para o PPV, sendo os genes da VP1/VP2 a região alvo. Esses genes têm sido muito utilizados para determinação de análises filogenéticas de isolados do PPV e embora apresente regiões variáveis entre as amostras de parvovírus, são capazes de detectar o PPV

seletivamente (Molitor et al., 1991;

Zimmermann et al. 2006). Quando avaliada a especificidade analítica dos iniciadores de PPV frente a DNAs não alvos como os

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evidenciada nenhuma amplificação

inespecífica.

Na etapa de otimização da PCR, quando

foram realizadas as variações nas

temperaturas de anelamento (54, 55, 56 e 57ºC), a que forneceu o melhor resultado foi

a de 57ºC. Nas condições descritas na tabela 8, a PCR foi capaz de amplificar um produto de 408 pb correspondente ao DNA do PPV. A figura 3 apresenta o resultado da amplificação do DNA dos controles positivos de PPV nas diferentes temperaturas de anelamento.

Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose 1,5% apresentando a amplificação dos produtos de 408 pb do PPV em diferentes temperaturas de anelamento. Canaleta 1: C+ PPV NADL-2 (Origem IPE3). Canaleta 2: C+ PPV cepa NADL-2 (Origem RO1). Canaletas 3 a 5: Controles negativos (reagentes menos o DNA). Canaleta 6: Padrão de tamanho molecular de 100 pb.

Na figura 3, observa-se que embora não tenha sido evidenciada a presença de

bandas inespecíficas nos controles

negativos em nenhuma das temperaturas de anelamento analisadas, optou-se por escolher a temperatura de 57ºC devido a

obtenção de uma banda de maior

intensidade do produto amplificado do PPV cepa NADL-2, como mostrado na canaleta 2.

O produto amplificado de 408 pb do controle

positivo de PPV foi submetido ao

sequenciamento e à análise por enzima de

restrição para determinação da

especificidade. O resultado do

sequenciamento forneceu uma sequência de nucleotídeos que ao ser comparada com outras sequências disponíveis no GenBank (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)

demonstraram ser provenientes do

Parvovirus Suíno.

Os programas Webcutter 2.0

(http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) e

pDRAW 32 foram utilizados para escolha da enzima de restrição a ser utilizada para determinar a especificidade do produto amplificado do C+ de PPV (figura 4). A partir da sequência de número de acesso JN400519.1 disponível no Genbank obtida

pelo Primer Blast (NCBI), foram

demonstradas as possíveis enzimas que poderiam clivar esse produto. As enzimas escolhidas foram HindIII e HphI. O programa pDRAW, ainda, demonstrou in

silico como seria a eletroforese em gel de

agarose da clivagem dessas enzimas (Figura 4).

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Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose in silico com o auxílio do programa computacional pDRAW32, mostrando os fragmentos gerados através das enzimas de restrição HindIII e HphI. Padrão de tamanho molecular de 100 pb.

A tabela 9 apresenta informações dessas enzimas de restrição como número de cortes, posição do sítio de clivagem e sequência de reconhecimento.

A clivagem dessas enzimas no produto amplificado do controle positivo de PPV é mostrada na figura 5.

Tabela 9 – Enzimas de restrição HindIII e HphI e suas informações como número de cortes, posição do sítio de clivagem e sequência de reconhecimento.

Enzima Número de Cortes Posição do sítio

de clivagem

Sequência de Reconhecimento (5’-3’)

HindIII 1 347 a/agctt

HphI 1 301 ggtga(n8) e (n7)tcacc

Fonte: Programas WebCutter 2.0 e pDRAW 32.

Figura 5 – Análise por enzima de restrição em eletroforese em Gel de agarose 2% dos produtos amplificados do DNA de PPV. Canaleta 1- Produto clivado pela ação da enzima HphI. Canaleta 2- Produto clivado pela ação da HindIII. Canaleta 3: Produto amplificado do C+ de PPV sem restrição enzimática. Canaleta 4- Padrão de tamanho molecular de 100 pb.

43 A partir dos resultados apresentados na

figura 5, observa-se que a restrição enzimática garantiu a especificidade do produto amplificado de PPV, uma vez que a clivagem dos mesmos pelas enzimas foi semelhante aos resultados apresentados na figura 4 e na tabela 1.

Molitor et al. (1991) padronizaram uma PCR que amplifica o gene da VP2, otimizando o

número de ciclos, temperatura de

anelamento e a concentração de magnésio a ser aplicada em amostras clínicas e na detecção deste agente como contaminante

em linhagens de células de mamíferos. Esses autores também utilizaram o critério de restrição enzimática para avaliar a

especificidade do produto amplificado,

sendo a enzima utilizada a EcoRI.

A sensibilidade analítica da PCR para PPV foi avaliada com as diluições seriadas (10-1 a 10-10) do DNA do controle positivo cuja concentração inicial foi de 31,5 ng/µL. Este vírus tinha sido previamente titulado por hemaglutinação e apresentou o título hemaglutinante de 128. A figura 6 apresenta a sensibilidade analítica desta PCR.

Figura 6 - Sensibilidade analítica da PCR para PPV com diluições seriadas do DNA desse agente em eletroforese em gel de agarose 1,5%. Canaletas de 1 a 10 - Diluição do DNA de PPV de 10-1 a 10-10. Canaletas 11 e 12 - Controles negativos contendo reagentes da PCR menos DNA. Canaleta 13 - Padrão de tamanho molecular de 100 pb.

Como observado na figura 6, a sensibilidade analítica foi determinada até a diluição de 10-7, correspondendo a 6,3 fg de DNA do

PPV (título hemaglutinante 128),

demonstrando assim uma alta sensibilidade. Molitor et al. (1991) obtiveram o limite de detecção de 100 fg de DNA desse vírus na padronização de uma PCR convencional para detecção do gene da VP2 do PPV em amostras clínicas e como contaminante celular.

Soares et al. (1999) encontraram um resultado semelhante ao determinaram a

sensibilidade analítica de uma PCR

convencional padronizada para detecção do gene NS1 do PPV à ser aplicada em amostras clínicas e na detecção deste agente como contaminante celular. A sensibilidade desta PCR foi determinada até a diluição de 10-9 do DNA de PPV cepa NADL-2 com título hemaglutinante 1024. Esse resultado corrobora o encontrado em nosso estudo, permitindo reforçar a alta

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sensibilidade analítica da PCR para PPV encontrada.