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Considerando o estresse oxidativo como um desequilíbrio entre as concentrações de oxidantes e antioxidantes, métodos para quantificá-lo incluem medidas diretas ou indiretas destas substâncias. Dada sua alta reatividade, a quantificação dos oxidantes e de alguns antioxidantes requer equipamento especializado e considerável experiência. Os processos de oxidação e redução podem ser monitorados, in situ, pela ressonância de spin de elétrons, mas este não é um método adequado para análises de rotina. Ao invés disto, métodos de medida indireta de oxidantes utilizando o corante fluorescente diclorofluoresceína são uma alternativa simples, apesar de relativamente não específica. A reação com oxidantes pode ser quantificada através do uso de uma placa de leitura de fluorescência ou através da citometria de fluxo.

Medidas de antioxidantes podem ter como objetivo estimar a capacidade antioxidante geral de um sistema ou determinar precisamente a concentração de antioxidantes específicos. Ensaios para a determinação da capacidade antioxidante total incluem os ensaios colorimétricos: estado antioxidante total (TAS), capacidade antioxidante equivalente ao Trolox (TEAC), parâmetro antioxidante de captação de radicais (TRAP) e potencial redutor e antioxidante férrico (FRAP). Uma característica comum destes ensaios é a tentativa de resumir a atividade de todos os sistemas antioxidantes em um único valor e de estarem disponíveis em kits comerciais (LYKKESFELDT; SVENDSEN, 2007). A capacidade antioxidante total (TAC) é um destes ensaios. A TAC é mais do que uma simples determinação analítica, e considera não somente a participação dos sistemas antioxidantes clássicos, mas também a de pró-oxidantes e antioxidantes ainda não bem definidos até o presente momento, na função de manter o equilíbrio redox (GHISELLI et al., 2000). Ela pode, assim, servir como auxiliar para a detecção, in vivo, de alterações relacionadas à ocorrência de estresse oxidativo, que não sejam observáveis através de análises específicas e isoladas de sistemas antioxidantes (GHISELLI et al., 2000).

As medidas mais específicas de antioxidantes incluem as dosagens das concentrações do ascorbato, da glutationa peroxidase e do α-tocoferol. Métodos específicos baseiam-se em cromatografia líquida de alta performance (HPLC), enquanto testes mais simples e menos sensíveis empregam técnicas de espectrofotometria. A maior desvantagem deste último tipo

de análise é o risco de auto-oxidação da amostra após a obtenção, levando a uma superestimação do estresse oxidativo (LYKKESFELDT, 2002).

Ainda entre os sistemas antioxidantes enzimáticos, podemos verificar a atividade das enzimas catalase, superóxido dismutase, por métodos colorimétricos (JOHANSSON; BORG, 1988; SUN et al., 1988).

As medidas do dano oxidativo têm se concentrado, tipicamente, sobre as três macromoléculas mais diretamente afetadas por ele: o DNA, as proteínas e os lipídeos. A quantificação do dano oxidativo ao DNA é geralmente feita por dois métodos. O primeiro é o ensaio COMET, que usa a eletroforese de gel para pesquisar semi quantitativamente o número de fitas de DNA quebradas em cada célula (COLLINS, 2004). O outro método envolve a quantificação de nucleotídeos e nucleosídeos oxidados por HLPC ou espectrometria de massa.

A medida da oxidação de proteínas é um processo bem mais simples, comumente utilizado como medida do dano oxidativo, apesar de alguns resultados ambíguos. Dada a sua formação precoce, sua grande estabilidade e duração prolongada, os produtos de oxidação das proteínas têm sido empregados como biomarcadores, no lugar dos marcadores de peroxidação lipídica (MASSY; NGUYEN-KHOA, 2002; DALLE-DONNE et al., 2003) A oxidação das proteínas é frequentemente pesquisada através da presença de grupos carbonil, que são o resultado da oxidação de aminoácidos mediada por radicais livres não específicos. Vários testes existem para este fim. Os métodos aplicados para esta identificação são colorimétricos, a maioria com limitada especificidade. Na maioria dos casos, um homogenato ou fração microssomal reage com a dinitrofenilhidrazina (DNPH), um composto que forma um derivativo de forte absorbância, ao reagir com grupos carbonil (DALLE-DONNE et al., 2003). O aumento da absorbância a 370 nm é interpretado como um indicador do aumento da oxidação proteica. Métodos mais sofisticados para este fim já estão disponíveis, mas requerem caros equipamentos e geralmente tem baixa sensibilidade, uma vez que apenas algumas, dentre as inúmeras modificações nos aminoácidos, são quantificadas. O método espectrofotométrico do DNPH é útil para quantificar grupos carbonil no plasma, homogenatos tissulares, extratos celulares ou proteínas isoladas.

Os lipídeos, em particular os poli-insaturados, são predispostos aos processos de oxidação. A ocorrência de oxidação lipídica pode ser pesquisada de várias maneiras, mas dois grupos de ensaios se destacam nesta tarefa, o do malondialdeido (MDA) e o do isoprostano. O MDA é um subproduto frequentemente quantificado como medida dos hidroperóxidos de

lipídeos, dando origem ao termo peroxidação lipídica para a designação de seu processo de formação. O ensaio de MDA envolve a reação com o ácido tiobarbitúrico, seguida da determinação espectrofotométrica (ESTERBAUER; ZOLLNER, 1989), e é frequentemente denominado de ensaio das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Este ensaio tem baixa especificidade e é sujeito à formação de artefatos, uma vez que apenas uma fração do MDA é gerada in vivo. Ainda mais, o MDA pode ser gerado in vivo por outros processos que não a peroxidação lipídica. A despeito destas considerações, o método permanece como um dos mais úteis e mais frequentemente empregados para aferir o dano oxidativo em função de sua simplicidade. Na verdade, o ensaio do MDA demonstrou ser um dos melhores preditores do dano oxidativo e geralmente mostra excelente correlação com outros marcadores, como o isoprostano, que é considerado como o mais confiável, em relação à peroxidação lipídica (MORROW; ROBERTS, 2000). Originalmente os ensaios do isoprostano requeriam equipamento de espectrometria de massa, limitando seu uso, mas hoje em dia testes de ELISA já estão comercialmente disponíveis.