Meijer et al. (2003) demonstraram que o processamento do sangue humano resultava num hemoderivado com propriedades terapêuticas. O produto, resultante da centrifugação do sangue, após incubação por 24 horas, a 37ºC e 5 % de CO2 no interior de uma seringa
contendo esferas de vidro tratadas com sulfato de cromo, consistia em soro enriquecido com a proteína antagonista do receptor de IL-1 (IL-1ra), entre outras citocinas anti-inflamatórias. Os autores verificaram que as concentrações de IL-1ra aumentaram 140 vezes, e que as citocinas anti-inflamatórias IL-4 e IL-10 tiveram sua síntese ligeiramente aumentada após o processamento. Eles propuseram, então, que o aumento nas concentrações de citocinas anti- inflamatórias devia-se à estimulação físico-química de células mononucleares do sangue pelas esferas tratadas. O hemoderivado obtido foi denominado de soro condicionado autólogo (SCA) e seu emprego terapêutico foi sugerido, sob o nome comercial de IRAP.
Dado o papel primordial da IL-1 na patogenia das enfermidades articulares (MORRIS et al., 1990; ALWAN et al., 1991a; FERNANDES; MARTEL-PELLETIER; PELLETIER, 2002) o emprego do IL-1ra reveste-se de especial significado para o controle da evolução e
dos sintomas a elas associados. Seu emprego visa antagonizar as ações da IL-1 nas células dos tecidos articulares (HENDERSON et al., 1991), atravésdo bloqueio competitivo dos receptores para a IL-1 (AREND et al, 1990).
Desde então, o ACS têm sido empregado em equinos para o tratamento de OA, principalmente. Resultados de estudos experimentais (FRISBIE et al., 2007) e clínicos mostram a eficácia do ACS no tratamento das enfermidades articulares dos equinos (WEINBERGER, 2008). Seu emprego profilático, após a realização de artroscopias, justifica- se por suas propriedades anti-inflamatórias e condroprotetoras, observadas tanto em equinos (TEXTOR, 2011) como na espécie humana (DARABOS et al., 2009; DARABOS et al. 2011).
A determinação do volume de ACS a ser injetado é feita empiricamente, nos equinos. Meijer et al. (2003) estimaram que sendo a concentração média de IL-1ra no ACS de 3 ng/ml e a concentração média de IL-1 no LS de articulações humanas acometidas por OA de 2,5 pg/ml, o volume de 2ml, recomendado para injeção em joelhos de pacientes humanos, proveria 6ng/ml de IL-1ra (FIRESTEIN et al., 1990). Granowitz et al. (1991) propuseram que uma relação de IL-1/IL-1ra de no mínimo 1:10 seria necessária para inibir a atividade da IL-1. No LS de equinos estas determinações não foram realizadas, e os volumes utilizados variam entre os autores. Weinberger (2008) utilizou volumes de ACS que variaram de 2 a 8 ml, dependendo do tamanho das articulações tratadas, enquanto Frisbie et al. (2007) utilizaram 6ml de ACS em estudo experimental utilizando articulações do carpo de equinos. Textor (2011) propôs injeções intra-articulares de 2ml de ACS, semanalmente, num total de 4 aplicações, para articulações metacarpo/metatarso- falangeanas.
Em 2008, um produto similar ao IRAP, denominado de IRAP II, foi desenvolvido por outra companhia, como meio alternativo de produção de SCA. Neste produto, apesar do emprego de uma seringa semelhante à utilizada para a obtenção do SCA com o kit IRAP, bem como de protocolo de processamento semelhante, as concentrações de IL-1ra reportadas eram sete vezes maiores e a relação entre as concentrações de IL-1ra e IL-1β eram quatro vezes maiores.
Hrara et al. (2011) demonstraram que tanto no IRAP como no IRAP II as concentrações de IL-1ra estavam a aumentadas, mas que após 24 horas de incubação, o kit IRAP II fornecia maiores concentrações de IL-1ra, em comparação com o IRAP. Ainda neste experimento, incubando o sangue de equinos para a obtenção de plasma (utilizando tubos heparinizados, ao invés das seringas provenientes dos kits comerciais) e soro (através da
adição de sangue a tubos sem anticoagulante) conforme preconizado por Meijer et al. (2003), estes autores verificaram expressiva síntese de IL-1ra e IL-10. A síntese de IL-1ra no soro incubado em tubos secos foi equiparável à observada no IRAP-1. Em relação ao plasma, a adição do sangue a tubos contendo heparina causou redução significativa das concentrações de IGF-1, TNF-α e TGF-β, mas aumentou a concentração de IL-1ra em 1,5 vezes. Em resumo, os autores consideraram surpreendente o aumento de citocinas anti-inflamatórias verificados no soro e no plasma, a despeito da não utilização dos kits comerciais IRAP e IRAP II. Eles atribuíram este achado à propriedade estimulante do vidro sobre o sangue total, conforme postulado por Meijer et al. (2003). Anteriormente Kampschmidt, Worthington e Mesecher (1986) haviam reportado o efeito estimulante da sílica sobre macrófagos de coelhos, incrementando a produção de IL-1.
Além da não obrigatoriedade das seringas provenientes dos kits para a obtenção do hemoderivado enriquecido em citocinas anti-inflamatórias, o estudo de Hrara et al. (2011) demonstrou a importância do tempo de incubação do sangue para a concentração destas citocinas de interesse, no produto final. Em todos os produtos (IRAP, IRAP II, sangue e plasma) a incubação por 24 horas aumentou em 250 vezes a concentração de IL-10, quando comparada àquela presente nas amostras após 1 hora de incubação.
A IL-10 é reconhecida como a mais importante citocina anti-inflamatória (OPAL; DE PALO, 2000), sendo capaz de modular a resposta leucocitária (ADIB-CONQUI; CAVAILLON, 2009) e a geração de radicais livres em macrófagos (DOKKA et al., 2001) e neutrófilos, inibindo a fosforilação de um dos componentes da NADPH oxidase (DANG et al., 2006). Estas propriedades levam muitos autores a especular sobre sua participação nos efeitos benéficos do SCA, quando empregado para o tratamento das enfermidades articulares.
Em relação à terapia com SCA algumas questões fundamentais permanecem. Uma delas refere-se à diversidade de moléculas presentes em sua composição. O SCA é composto de várias citocinas anti-inflamatórias e potencialmente benéficas para o tratamento das artropatias. Resultados de estudos empregando espectroscopia de massa confirmam a presença de muitas citocinas no SCA e pesquisas futuras devem ser conduzidas nesta área. Também não se sabe, ao certo, qual o verdadeiro papel de cada componente, ou o de sua associação, no desencadeamento dos efeitos desejáveis do SCA (CHEVALIER, 2010). Wehling et al. (2007) lembram que enquanto o IL-1ra pode desempenhar um papel importante na composição deste soro clinicamente ativo, ele não é o único fator presente. Algumas citocinas anti-inflamatórias nele presentes, como a IL-10, também possuem efeito
antioxidante. Este efeito pode representar uma alternativa ou um complemento para a explicar os mecanismos de ação do SCA.
Com base nestas observações, Brossi, Baccarin e Massoco (2012) empregaram plasma processado, como descrito por Hrara et al. (2011), utilizando tubos de vidro heparinizados, para constituir o hemoderivado que empregaram sobre células do líquido sinovial equino. Resumidamente, células obtidas do LS de equinos livres de doenças articulares foram utilizadas para constituir um pool celular, que foi estimulado, in vitro, para a produção de EROs. A adição do plasma processado inibiu significativamente a geração de radicais livres por estas células, demonstrando seu efeito antioxidante.
O plasma assim processado foi denominado de plasma processado autólogo (PPA); sua composição foi determinada in vitro, e seus efeitos a curto e longo prazo, sobre articulações de equinos sadios, foram observados in vivo (MOREIRA et al., 2014)1. A aplicação do produto revelou-se segura e o processamento do sangue resultou em aumento das concentrações de IL-1ra, sem incremento concomitante das concentrações de citocinas inflamatórias. A curto prazo, dentro das 48 horas seguintes à aplicação, o PPA desencadeou uma leve e transitória resposta inflamatória. Com um protocolo de aplicação semanal, no entanto, a administração de PPA resultou em menores concentrações de PGE2 e CS no líquido
sinovial, e em contagens inferiores de células nucleadas totais (MOREIRA et al., 2014)1 .
1MOREIRA, J. J.; MORAES, A. P. L.; BROSSI, P. M.; MACHADO, T. S. L.; MICHELACCI, Y. M.; MASSOCO, C. O.; BACCARIN, R. Y. A. Autologous processed plasma: cytokine profile and effects upon injection in healthy equine joints. (Aceito para publicação em 2014). Pré-print.
3 JUSTIFICATIVA
O uso de hemoderivados para o tratamento de lesões musculoesqueléticas tornou-se frequente na clínica ortopédica equina. Isto se deu em função da alta prevalência de injúrias do aparelho locomotor, fomentada pelo crescente número de participantes em atividades atléticas, na espécie. Apesar do emprego assíduo na clínica ortopédica, a composição dos hemoderivados não foi satisfatoriamente padronizada e dificuldades para obter esta padronização advém de particularidades dos derivados autólogos, relacionadas a características intrínsecas dos doadores. Adicionalmente, os hemoderivados são obtidos por metodologias distintas e exercem seus efeitos através de mecanismos ainda não totalmente esclarecidos.
As propriedades antioxidantes do PPA, demonstradas anteriormente sobre células do líquido sinovial equino estimuladas in vitro (BROSSI; BACCARIN; MASSOCO, 2012), despertaram interesse para o potencial efeito do hemoderivado sobre a geração de radicais livres e para sua influência sobre os sistemas antioxidantes no líquido sinovial de equinos acometidos por enfermidades articulares, in vivo.
As lacunas existentes na demonstração e na compreensão dos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios dos hemoderivados, in vivo, somadas à escassez de estudos verificando os múltiplos aspectos do equilíbrio redox no líquido sinovial de equinos portadores de enfermidades articulares motivaram a realização deste trabalho.
4 OBJETIVO
Os principais objetivos deste estudo foram:
1. Identificar alterações no equilíbrio redox e no metabolismo dos tecidos articulares em equinos acometidos por OA ou OCD e submetidos à artroscopia, no período pós- operatório imediato;
2. Comparar a OA e a OCD, quanto a características do equilíbrio redox e aspectos inflamatórios e metabólicos articulares neste período;
3. Avaliar os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios do PPA no período pós- operatório imediato em articulações acometidas por OA ou OCD tratadas por artroscopia.