Na realização deste estudo existiram algumas dificuldades que limitaram a concretização de alguns dos seus objectivos e, necessariamente, os resultados:
O tempo de realização do estudo foi limitado, sendo a dimensão da amostra a considerada suficiente para, dentro das limitações orçamentais, poder concluir o estudo. Um período mais alargado de recrutamento de doentes ou, eventualmente, o seu prolongamento por um segundo inverno, poderia aumentar a robustez dos resultados obtidos.
O facto de os dados terem sido, no momento inicial, recolhidos por diferentes médicos da equipa poderá condicionar algum enviezamento, relacionado com a subjectividade da prática médica. Tentámos reduzi-la ao mínimo, em reuniões periódicas da equipa, com o objectivo de uniformizar critérios e estratégias adoptadas à medida em que decorria o estudo.
A reavaliação das crianças por via telefónica foi adequada nos casos em que não se verificaram novos episódios de sibilância. No entanto, no escasso número dos classificados como sibilantes apenas reavaliados telefonicamente, o esclarecimento da gravidade da patologia e a exclusão de causas orgânicas podem não ser absolutas. Seria importante utilizar um método laboratorial com capacidade de identificação de Metapneumovírus humano. Trata-se de um agente muito frequente de bronquiolite aguda, que poderá ter sido responsável por uma percentagem importante dos casos estudados. A evolução ulterior destas crianças e o comportamento das citocinas nasais nesses casos poderia ser interessante.
Um estudo mais exaustivo das citocinas, nomeadamente através do isolamento e identificação das diferentes populações celulares responsáveis pela sua síntese, poderia proporcionar informação mais detalhada que a que obtida neste estudo. Seria, no entanto, necessária maior diferenciação, por parte dos investigadores envolvidos, quanto a procedimentos laboratoriais, aspecto ainda não exequível no presente.
Ao longo do seguimento, poderia ser mais informativo avaliar a gravidade e o grau de sibilância recorrente em cada doente, estratificando-os por de acordo com o grau de gravidade da sua situação. As crianças com sibilância recorrente evoluem de forma
heterogenia, pelo que a informação resultante de uma análise desse tipo poderia ser interessante. Não foi, no entanto, essa a opção tomada no decorrer desta investigação. Seria necessário estudar um maior grupo de crianças para retirar conclusões com significado.
DA METODOLOGIA
A presente investigação foi idealizada como um estudo de coorte. O primeiro passo consistiu na definição de uma amostra de doentes, subsequentemente acompanhada ao longo de um determinado período, com a finalidade de estudar a sua evolução clínica.
De acordo com os critérios propostos por Norman (2000), a dimensão da amostra (150 crianças) pode considerar-se adequada para retirar conclusões válidas do ponto de vista estatístico. Atendendo à prevalência da sibilância recorrente após bronquiolite, estimada em 50%, uma amostra de 60 crianças permitiria a realização do estudo. É, pois, legítimo afirmar que o número de casos recrutados é representativo da população estudada.
As crianças foram incluídas no estudo ao recorrerem ao serviço de urgência pediátrica do HSFX (hospital central), por ocasião de um primeiro episódio de sibilância. A população base é muito heterogénea do ponto de vista socioeconómico e cultural, o que refecte as características da comunidade em que o hospital se encontra inserido. O tipo de organização actual dos serviços de saúde permite, por outro lado, que as famílias recorram a serviços de urgência pediátrica por iniciativa própria, sem referenciação. Esta circunstância leva a que a amostra avaliada neste estudo represente, muito provavelmente, a apresentação clínica da generalidade dos casos de bronquiolite aguda na comunidade e não apenas a dos casos mais graves, o que seria expectável em meio hospitalar.
A investigação teve início no momento do episódio inaugural de bronquiolite aguda e não no momento do nascimento, metodologia utilizada nas investigações publicadas por autores como, entre outros, Martinez (1995), Illi (2001), Lau (2002), Neaville (2004), Wright (2004), Brussee (2005), Nafstad (2005), Matsumata (2005), Arora (2006), Asher (2006), Lemanske (2006), Ly (2006), Uekert (2006), Bisgaard (2007), Piippo- Savolainen (2008) e Epton (2007). O nosso objectivo consistiu em identificar os diferentes comportamentos clínicos das crianças após um primeiro episódio de bronquiolite aguda, e não determinar a probabilidade de aparecimento ulterior de
manifestações clínicas num grupo previamente identificado como tendo maior risco de doença atópica. Procurámos, desta forma, identificar parâmtros associados ao aparecimento de sibilância recorrente numa população de lactentes que, à partida, não manifestavam qualquer factor predisponente.
A inclusão das crianças foi efectuada no seviço de urgência. Com a finalidade de recrutamento do maior número de doentes e de distribuição aleatória por todos os dias da semana, contámos com a colaboração de vários médicos, integrados nas equipas de urgência dos diversos dias da semana. É possível admitir que os critérios utilizados por cada médico tenham implicado certo grau de subjectividade inerente à prática clínica. Tentámos reduzir ao mínimo esse possível condicionalismo em reuniões periódicas do grupo de trabalho e pela revisão exaustiva, pelo investigador principal, de todos os processos clínicos e questionários.
Os doentes internados foram acompanhados clinicamente, durante esse período, pelo investigador principal.
No que diz respeito aos doentes que tiveram alta após a observação no serviço de urgência, e cujo primeiro episódio de bronquiolite decorreu em ambulatório, é também de admitir a existência de algumas diferenças, entre os vários colaboradores, quanto aos critérios de observação e orientação. Este aspecto mereceu a nossa atenção ao longo do tempo do estudo, através da concretização de reuniões periódicas para garantir da uniformização, dos procedimentos adoptados.
A patologia que estudámos foi definida, predominantemente, por critérios de exclusão. Considerámos que uma criança teria sibilância recorrente apenas se tivessem sido excluídas as entidades nosológicas anatómicas, funcionais ou imunológicas enumeradas no quadro 1. Como tal, os doentes foram incluídos no estudo após o primeiro episódio de sibilância, apenas se nenhuma dessas etiologias fosse evidente e se, concomitantemente, não existissem antecedentes de prematuridade ou de doença crónica. Uma vez que os corticosteróides poderiam modificar as respostas imunes que pretendíamos estudar, excluímos igualmente, logo no primeiro contacto, os doentes que tivessem sido medicados com esses fármacos por via sistémica ou inalatória nas duas semanas precedentes.
Ao longo das várias observações em consulta, para respeitar os critérios pré-definidos, foram igualmente excluídos os doentes em que, ao longo do tempo foram comprovadas as entidades enumeradas.
O seguimento das crianças foi efectuado em consulta hospitalar de pneumologia pediátrica, proposta a todos os doentes incluídos no estudo. A observação clínica neste contexto foi, mais uma vez e em todos os casos, efectuada pelo investigador principal, a fim de uniformizar as características dos dados colhidos e critérios utilizados. Todos os exames necessários para o esclarecimento da situação clínica foram efectuados no HSFX, de acordo com critérios clínicos e boas práticas médicas.
Consideramos que a frequência trimestral de consultas foi a adequada ao seguimento clínico, nomeadamente para evitar falhas de memória por parte das famílias, acerca do número e gravidade das crises de sibilância e da terapêutica efectuada.
A medicação de fundo indicada neste escalão etário não se encontrava, no período de realização deste estudo, bem definida. Sempre que considerado necessário, pelo número e gravidade das crises, adaptámos as recomendações propostas pelo grupo GINA (2006), incluindo a prescrição de corticosteróides inalados ou modificadores orais dos leucotrienos.
A reavaliação por via telefónica foi a solução que nos pareceu adequada para a obtenção de informações acerca das crianças que não compareceram à consulta. Esta metodologia, de elevada confiabilidade no caso das crianças não sibilantes, foi aplicada com periodicidade trimestral, através de um questionário uniforme, que incidiu sobre o número, gravidade, frequência e terapêuticas das crises, terapêutica de fundo, recurso a consultas de urgência e necessidade de internamentos hospitalares (Chong-Neto 2007). A classificação das crianças como sibilantes foi igualmente possível; quanto à avaliação da gravidade da situação, admitimos que este procedimento possa ter sido mais falível. Os familiares foram igualmente interrogados sobre o seguimento efectuado pelos médicos assistentes, eventuais investigações complementares efectuadas e seus resultados. A exclusão das crianças do grupo avaliado por via telefónica seguiu critérios
semelhantes aos usados nos doentes observados com regularidade na consulta hospitalar.
No respeitante à recolha desta informação é possível que se tenha verificado menor grau de rigor. No entanto, na sociedade contemporânea, dado o papel preponderante desempenhado pelas telecomunicações em inúmeros aspectos da vida quotidiana e da própria prática clínica, aceitamos que os dados obtidos telefonicamente tenham tido validade comparável aos obtidos pessoalmente. Noutros estudos, Bowling (2005) considerou a qualidade da informação recolhida por via telefónica semelhante à obtida presencialmente e Kempf (2007) valorizou de forma clara a comunicação telefónica na recolha de dados em investigação clínica. Tal como nós, autores como Castro- Rodriguez (2000), Ball (2000), Sherriff (2001), Cifuentes (2003), Garciuño (2003), Gern (2004), Stensballe (2006), Ly (2006), Lazzaro (2007), Ramsey (2007) e Bisgaard (2007), entre outos, incluiram dados colhidos dessa forma, sem que se verificasse diminuição da sua fiabilidade.
Sublinhamos igualmente que, no caso das crianças não sibilantes, não era eticamente defensável exigir a deslocação de uma criança e da sua família a um hospital, durante o horário habitual de trabalho, se a situação clínica o não justificasse. Esta consulta desnecessária poderia ter diversas consequências socioprofissionais, o que não seria justificável nem desejável.
O principal objectivo deste estudo foi a pesquisa de parâmetros associados a maior probabilidade de evolução para sibilância recorrente, após uma primeira bronquiolite ocorrida até aos 24 meses de idade. Deste modo, a escolha das variáveis a investigar resultou de uma pesquisa bibliográfica prévia e exaustiva sobre factores de risco associados à sibilância recorrente.
Elementos como a idade, sexo, raça, classe social, número de coabitantes, existência de irmãos, frequência de infantário, aleitamento materno, atopia no próprio ou em familiares, contacto com tabaco, contacto com animais domésticos, gravidade do primeiro episódio, estirpe vírica isolada, têm sido amplamente estudados, embora com resultados por vezes contraditórios. As outras variáveis que considerámos importantes resultaram da nossa experiência clínica, que nos levou a equacionar a influência de
outros elementos na evolução das crianças após uma primeira bronquiolite. Destes, considerámos importante conhecer, nomeadamente, alguns determinantes do paradigma Th1/Th2, que detectámos de forma não invasiva no decorrer do episódio inicial.
A definição da data da primeira bronquiolite de acordo com a divisão do ano em semanas epidémicas (Centers for Disease Control and Prevention e Organização Mundial de Saúde) é uma forma universalmente aceite de datar e acompanhar a evolução de epidemias (CDC 2007). Neste estudo a sua utilização justifica-se, uma vez que a etiologia da bronquiolite aguda é predominantemente vírica, tendo em conta os agentes etiológicos e a sazonalidade desta entidade clínica.
O nível mais elevado de escolaridade atingido por um dos progenitores é um critério representativo do nível sócio-económico da família em que cada criança está integrada, conforme demonstrado por diversos investigadores como Mielck (1996), Klinnert (2001), du Prel (2006) e Pawliska-Chmara (2007). A escala de Graffar adaptada à realidade portuguesa, comum noutros estudos, é considerado por alguns um método antigo, desactualizado, pouco objectivo e que necessita, para uma classificação adequada, da formulação de um excessivo número de questões. É provável que outros métodos de estratificação social, oriundos das ciências sociais e políticas, permitam uma melhor classificação das famílias. No entanto, o que foi utilizado é um método bastante objectivo e de fácil colheita, correlacionável, mesmo intuitivamente, com as condições de vida das famílias em que as crianças se incluem (du Prel 2006, Pawliska-Chmara 2007).
Definimos tabagismo passivo como o contacto domiciliário, por parte das crianças, com fumo de tabaco, independentemente das condições e tipo de consumo tabágico praticado pelos familiares. Metodologia semelhante, baseada em questionários aos pais, foi utilizada por autores como Garciuño (2003), Taussig (2003), Bradley (2005), Pitrez (2005), Feleszko (2006), Chong-Neto (2007) ou Morais-Almeida (2007). As crianças que estudámos, pelo seu escalão etário, poderão ser influenciadas por baixas concentrações de fumo de tabaco, presente em roupas ou noutros objectos. Como tal, assumimos existir contacto significativo das crianças com fumo de tabaco mesmo nos casos em que os pais garantiam não fumar em casa. Seria eventualmente mais informativo quantificar a nicotina absorvida, através de doseamentos de cotinina sérica
das crianças, como efectuado por, entre outros autores, Noakes (2003) ou Kelley (2006). Trata-se poi de um tópico de investigação a desenvolver no futuro.
Os hábitos tabágicos da mãe durante a gravidez foram considerados como presentes ou ausentes, independentemente do tipo e quantidades consumidas. Para o estudo deste factor de risco poderia ser útil quantificá-lo de forma mais pormenorizada. É consensual, no entanto, que mesmo pequenas concentrações de nicotina a nível fetoplacentar poderão influenciar o desenvolvimento estrutural e funcional do aparelho respiratório fetal, como demonstrado por Martinez (1995), Gern (1999), Stick (2000), Sherriff (2001), Bracken (2002), Barrett (2002), Garciuño (2003), Noakes (2003), Janson (2004), Bradley (2005), Landau (2006), Le Soeuf (2006), Pattenden (2006), Morais-Almeida (2006) ou Lannerö (2006).
Considerando a composição do leite humano, é possível que alguns benefícios imunológicos do aleitamento materno possam ser obtidos mesmo nos casos em que se verifica aleitamento misto durante os primeiros meses de vida. No entanto, para melhor objectivar essa variável, incluímos no grupo de crianças alimentadas com leite materno apenas os casos em que este foi referido, em exclusivo, até aos três meses de idade (Taussig 2003, Wright 2004, Wills-Karp 2004, de Silva 2004, Kull 2005, Obihara 2005, Friedman 2005, Vercelli 2006, Liu 2006, Chantry 2006, Schaub 2006, Prescott 2006, Paricio-Talayero 2006, Lee 2007, Bryan 2007, Piippo-Savolainen 2008).
Em relação à frequência diurna de espaços comuns (creches, infantários ou amas com mais de seis crianças), apenas a considerámos após os quatro meses de idade, no pressuposto de que a generalidade da população beneficiaria da legislação em vigor, que permite a estadia da crianças com a mãe até essa idade. Algumas crianças incluídas no estudo poderão ter frequentado espaços comuns ainda antes de atingirem essa idade, o que poderá repercutir-se na evolução da sua sintomatologia respiratória.
Em relação às variáveis clínicas estudadas, cabe referir que os antecedentes pessoais e familiares de atopia foram considerados apenas nos casos em que havia diagnóstico prévio. É do conhecimento geral que alguns sintomas são atribuídos de forma errónea, por parte das famílias, a fenómenos alérgicos. Desta forma, somente foram consideradas as informações de “alergia alimentar” ou “medicamentosa”, “asma” ou “eczema”, entre
outras, baseadas numa observação clínica prévia. Esta estratégia teve o propósito de tentar diminuir os falsos positivos associados a esta variável.
A classificação da gravidade do episódio inicial de sibilância foi atribuída pelo médico que observou a criança no serviço de urgência e, posteriormente, confirmada pelo investigador principal. Adaptámos para este estudo o índice de gravidade da bronquiolite desenvolvido por Wang e colaboradores em 1992, por nos parecer objectivo e baseado em critérios clínicos simples. O mesmo obrigou à observação e registo atento e sistemático de cinco dados importantes da observação clínica (frequência respiratória, presença de tiragem, dados da auscultação pulmonar, quantificação do estado geral e cor da pele), bem como um dado complementar (SpO2),
disponível e acessível em todos os serviços de urgência pediátrica. Tal critério de pontuação permitiu quantificar dados frequentemente baseados em critérios intuitivos. O cuidado colocado na observação clínica foi, desta forma, útil para os doentes. Por outro lado, entendemos ser legítimo afirmar, pela objectividade dos parâmetros utilizados, que a utilização desse índice de gravidade é susceptível de aumentar a reprodutibilidade deste estudo.
A necessidade de internamento baseou-se na gravidade clínica da bronquiolite, sendo nalguns casos, ditada por aspectos sociais ou da relação médico doente. Desta forma, concluimos que esta variável não constituiu, só por si, um indicador aceitável da gravidade do episódio inaugural estudado.
Quanto às variáveis laboratoriais, alguns Ag virais foram pesquisados na mucosa nasal de todas as crianças, no momento da primeira bronquiolite. O teste laboratorial escolhido permitiu apenas a identificação dos seguintes agentes etiológicos: VSR, VPI, VI, Adenovírus.dos negativos possam estar associados a outros agentes como Rinovírus ou Metapneumovírus humano, não detectáveis por este método. Será interessante, noutra ocasião, estudar o comportamento dos doentes com bronquiolite associada a estas estirpes virais, que são responsáveis frequentemente por essa patologia ou por exacerbações de asma brônquica (Williams 2004, Mellendi 2007, Deffrasnes 2007, Silva 2007). Por outro lado, a metodologia que usámos não permitiu distinguir as situações de hiperreactividade brônquica intrínseca da associada com os agentes virais não detectáveis.
O método laboratorial usado para o estudo das citocinas intervenientes na imunidade nasal foi propositadamente adaptado para este estudo. De acordo com a bibliografia consultada, tal estratégia não tinha sido ainda utilizada por outros investigadores em moldes sobreponíveis. Consideramos que a utilização deste tipo de exame permitiu o estudo não invasivo de alguns aspectos da imunidade local no decorrer de uma bronquiolite aguda, nomeadamente através da determinação do comportamento das citocinas associadas ao paradigma Th1 / Th2 e da sua eventual relação com a evolução clínica nos meses subsequentes (Till 2001, Bont 2001, Oh 2002, Boelen 2002, Shahid 2002, Kazachkov 2002, Tripp 2002, Legg 2003, Joshi 2003, Koopman 2003, Stokes- Peebles 2004, Copenhaver 2004, Schauer 2004, Spann 2004, Pitrez 2005, van Benten 2005, Vercelli 2006, Pinto 2006, Duramad 2006, Culley 2006, Becker 2006, Gern 2006, Midulla 2006, Truyen 2006, Puthotu 2006, Stern 2007, Melendi 2007, Chung 2007).
As citocinas são moléculas intervenientes na comunicação entre diversas populações celulares que participam na resposta imune. A “mensagem” que as citocinas transmitem define o tipo de resposta que ocorrerá subsequentemente; com acção exclusivamente local, a nível dos tecidos implicados, actuam em concentrações muito baixas, e têm semividas muito curtas. Será, pois, legítimo especular que, quando se pretende investigar o papel local das citocinas em determinado órgão ou sistema, as determinações devem ser efectuadas em amostras recolhidas a esse nível, e não em células sanguíneas, que poderão eventualmente não reflectir com rigor os fenómenos locais (Copenhaver 2004, Guerra 2004, Stokes-Peebles 2004, Teixeira 2005, van Benten 2005, Friedlander 2005, Oh 2005, Rebordão 2006, Phaybouth 2006, Culley 2006, Truyen 2006, Midulla 2006, Lewis 2006, Melendi 2007, Stern 2007).
Uma vez que, no presente estudo, pretendíamos estudar o comportamento de determinadas citocinas no decorrer de uma bronquiolite aguda, consideramos que o procedimento mais indicado seria o estudo de produtos biológicos provenientes da árvore brônquica distal (lavado broncoalveolar). Têm sido publicados estudos aplicando esta metodologia, principalmente em doentes ventilados ou com indicação clínica para a realização de broncofibroscopia e colheita de lavado broncoalveolar (Krawiek 2001, Mcnamara 2004, Brown 2005, Maclennan 2006). Não sendo este o contexto da população estudada optámos, naturalmente, pelo estudo de produtos biológicos de
origem mais proximal, colhidos nomeadamente à superfície da mucosa nasal. Na realidade, como referido por Tauber (2002), Rosado-Pinto (2003), Romagnani (2004), entre outros, o aparelho respiratório reage de forma uniforme após um estímulo ou uma agressão. Os resultados dos estudos efectuados em produtos oriundos das vias aéreas superiores poderão, desta forma, traduzir os fenómenos que ocorrem a nível dos brônquios, bronquíolos e alvéolos pulmonares (Kazachkov 2001, Till 2001, Smyth 2002, Bergoin 2002, Tauber 2002, Bergoin 2002, Mobbs 2002, Joshi 2003, Legg 2003, de Waal 2003, Giugno 2004, Garofalo 2004, Gern 2004, van Benten 2005, Pitrez 2005, Midulla 2006, Pacifico 2006). O respeito aos princípios éticos teve igualmente importância nesta decisão.
A semivida extremamente curta das citocinas, bem como a sua baixa concentração tornam o seu doseamento directo a nível sérico, urinário ou tecidual extremamente difícil e falível. Apesar dos anteriores estudos de autores como Noakes (2003), Friedlander (2005), Guerrero (2005) ou Ly (2007), que investigaram o comportamento das citocinas no sangue do cordão umbilical e outros como Leech (2000), Tripp (2002), Aoyagi (2003), Guerra (2004), Heaton (2005), Rebordão (2006) ou Pinto (2006), que efectuaram estudos semelhantes a nível do sangue periférico, optámos por determinar, a actividade das citocinas de forma indirecta, pesquisando a expressão génica dos ácidos nucleicos que as codificam.
Sabendo que as citocinas que escolhemos são sintetizadas nas células da mucosa nasal, exclusivamente por determinadas populações celulares (linfócitos Th1 e Th2, macrófagos e células natural killer), determinámos a sua actividade através da quantificação, por RT-PCR, da expressão dos seus genes.