Observasjon IV

No presente trabalho foi utilizado um modelo para estudos de pluripotência celular por indução de diferenciação em culturas de carcinoma embrionário humano da linhagem NTera-2 padronizado em nosso grupo em um trabalho anterior a este para a pesquisa de fatores de transcrição que possam atuar nos processos de manutenção da pluripotência e diferenciação celular, de maneira positiva ou negativa (LIMA; PANEPUCCI, 2013). A linhagem de carcinoma embrionário NTera-2 foi escolhida por ter características semelhantes as células- tronco embrionárias humanas. Ela tem alta capacidade de diferenciação in vitro (PAL; RAVINDRAN, 2006), possui uma expressão gênica global similar às células-tronco embrionárias (SCHWARTZ et al., 2005) e são de fácil cultivo, crescem em meio D-MEM (do inglês, Dulbecco's modified Eagle's médium) suplementado com 10% de soro fetal bovino e sem a presença de outras células de suporte (fibroblastos alimentadores) bem como suplementos como LIF, bFGF e BMP (ANDREWS et al., 2005). Por meio deste trabalho prévio do nosso grupo vimos que as células de carcinoma embrionário NTera-2 perdiam gradativamente o seu perfil pluripotente quando cultivadas em meio acrescido com 10 µM de atRA. Esta indução da diferenciação celular se mostrou eficiente e condizentes com a literatura (ANDREWS, 1984, 1987; ANDREWS et al., 1984), ocorrendo durante os primeiros dias de tratamento e de forma tempo dependente. Tendo isto em mente, o primeiro obstáculo foi adaptar o modelo de indução da diferenciação para a demanda de material biológico exigida pelos ensaios de imunoprecipitação de cromatina.

A técnica de imunoprecipitação de cromatina recomenda a quantidade de células final para extração de DNA equivalente a 107 _{células por amostra analisada, uma quantidade útil}

para a realização de 10 imunoprecipitações (cromatina de 106 _{células por imunoprecipitação).}

Para conseguir esta quantidade de células precisamos transferir os experimentos padronizados em placas multi-well de 6 poços (aproximadamente 10 cm2 _{de área útil para o crescimento}

celular) para garrafas de cultura de 175 cm2 _{(T175) tomando os devidos cuidados para preservar}

as características pluripotentes das células. Somado a este impasse inicial, a linhagem NTera-2 não pode ser isolada da placa ou garrafa com o auxílio de enzimas digestivas, como a tripsina. Para fazer o repique é necessário usar um cell scraper em um isolamento mecânico. Com isto, parte das células são perdidas, seja por destruição da célula ou pelo estresse nelas imposto, o que pode também alterar a biologia celular da cultura. Diante disso, levamos em consideração que nem todas as células repicadas sobreviveriam ou se aderiam à superfície das garrafas.

Revolvemos começar com um repique de 107 _{células por garrafa, de forma que}

deixamos as células aderirem por 1 dia para depois continuarmos com o tratamento com atRA por 4 dias. As Figuras 8ª e 8B, retratam, respectivamente, células cultivadas em meio basal por 5 dias e células cultivadas em meio basal por 1 dia, em meio suplementado com 10 µM de atRA por 4 dias. Podemos perceber que na condição não tratada as células proliferaram mais que na condição tratada com atRA, o que já era esperado, uma vez que as células no processo de diferenciação reduzem a sua taxa de divisão celular. Deste modo, tínhamos uma grande quantidade de células na nossa situação não tratada em comparação as células tratadas, além do mais a cultura não tratada se apresentou com a formação de aglomerados celulares que tendem a se diferenciar espontaneamente. Com estes resultados resolvemos nas culturas seguintes fazer repiques com a metade de células utilizadas anteriormente, 5 x 106 _{células por garrafa, nas}

mesmas condições de desenvolvimento das culturas tratada e não tratada com atRA. As Figuras 8C e 8D, representam, respectivamente, as culturas não tratada e tratada com atRA nas condições previamente descritas. Podemos ver a existência de espaços não ocupados por células na superfície das garrafas, indicando pouca proliferação celular em ambas as condições. Com esta condição não obtivemos a quantidade de células desejadas para a realização do ChIP.

Em uma terceira etapa, tentamos chegar a um equilíbrio em relação ao número de células repicadas, de forma que elas tivessem um tempo maior para se restabelecerem na cultura

e continuassem a se proliferar até a condição que adotamos como a ideal. Realizamos os repiques iniciais com a mesma quantidade de células do ensaio anterior, 5 x 106 _{células, mas}

deixamos as células em cultura por 2 dias antes de começarmos o tratamento para indução de diferenciação com atRA por 4 dias. As Figuras 8E e 8F, mostram a cultura de células não tratada e a cultura de células tratadas com atRA, respectivamente. Em ambas as condições podemos ver que a cultura se encontra mais homogênea e as células se apresentam mais de acordo com o que se espera das linhagens de carcinoma embrionário NTera-2, uma morfologia de células epiteliais, com contato célula-célula para o bom desenvolvimento da cultura e manutenção do caráter pluripotentes da linhagem (ANDREWS, 2006). Nestas condições de passagem celular foi possível obter a quantidade de células necessárias para a aplicação da técnica de ChIP nas duas condições estudadas. Após chegarmos a conclusão do número adequado de células repicadas, do tempo necessário para que a cultura se restabeleça realizamos as culturas para indução de diferenciação com atRA e crosslinking ao final do período de tratamento, 4 e 8 dias. A Figura 9 mostra uma fotomicrofrafia de campo claro das culturas realizadas nos ensaios antes da etapa de crosslinking, em 9A as células após 2 dias de cultivo, antes do início do tratamento, B as células não tratadas com atRA com mais 4 dias de cultura e 9C e 9D, células submetidas à indução de diferenciação por 4 e 8 dias, respectivamente, após o prazo de adesão e reestabelecimento da cultura.

Figura 8 – Padronização. Nesta imagem encontram-se representadas seis fotomicrografias de cultura de células da linhagem NTera-2 submetidas ou não ao tratamento com atRA em garrafas de 175 cm2_{: A, repique inicial de 10}7

células em meio basal por 5 dias; B, repique inicial de 107 _{células em meio basal por 1 dia e em meio suplementado}

com 10 µM de atRA por 4 dias; C, repique inicial de 5 x 106 _{células em meio basal por 5 dias; D, repique inicial}

de 5 x 106 _{células em meio basal por 1 dia e em meio suplementado com 10 µM de atRA por 4 dias; E, repique}

inicial de 5 x 106 _{células em meio basal por 6 dias; F, repique inicial de 5 x 10}6 _{células em meio basal por 2 dias e}

Figura 9 – Cultura de células usadas para o ensaio de ChIP. Nesta imagem encontram-se representadas quatro fotomicrografias de cultura de células da linhagem NTera-2 submetidas ou não ao tratamento com atRA em garrafas T175: A, repique inicial de 5 x 106 _{células em meio basal por 2 dias; B, repique inicial de 5 x 10}6 _células

em meio basal por 6 dias; C, B, repique inicial de 5 x 106 _{células em meio basal por 2 dias e em meio suplementado}

com 10 µM de atRA por 4 dias; D, repique inicial de 5 x 106 _{células em meio basal por 2 dias e em meio}

suplementado com 10 µM de atRA por 8 dias (Aumento: 200X).