Todos os métodos descritos até aqui podem ser classificados como manuais e quantificam a resposta angiogênica de forma indireta, subjetiva e pouco precisa (PARKE et al., 1988; CONRAD et al., 1994; ZICHE, 2001). Alguns constituem procedimentos tediosos e que demandam um tempo significativo para realizá-los. Além disso, todos estão sujeitos a vieses por parte de quem os executa.
Pelas suas peculiaridades, os computadores se tornaram, com o tempo, ferramentas indispensáveis para facilitar e tornar mais objetivo o processo de quantificação de angiogênese. Os primeiros métodos de quantificação de angiogênese corneana assistidos por computador foram descritos na segunda metade da década de 80 (GLAT; KLINTWORTH, 1986; PROIA et al., 1988). Técnicas de processamento de imagens digitais possibilitaram a implementação de tais métodos. Entretanto, para realçar os vasos sangüíneos, a maioria das técnicas descritas desde então requer a realização de perfusão com um meio de contraste, como tinta da Índia ou, mais recentemente, compostos fluorescentes. Conseqüentemente, a córnea necessita ser removida, preparada e montada em lâminas, como anteriormente descrito. Trata-se, portanto, de medições pontuais.
Glat e Klintworth (1986) descreveram uma técnica, denominada de planimetria computadorizada, para mensuração do comprimento vascular total. Para tanto, com o auxílio de um planímetro computadorizado, delineava-se o traçado de cada vaso pertencente à zona de neovascularização, previamente rotulada com tinta da Índia, em fotografias convencionais da córnea. Ao final do processo, ou seja, após o delineamento de toda a rede vascular, o computador fornecia uma medida correspondente à soma de todos os segmentos traçados.
Proia et al. (1988) relataram um método para quantificar a neovascularização em imagens digitais, em tons de cinza, de córneas de rato cauterizadas com nitrato de prata/nitrato de potássio e montadas em lâminas, após
perfusão com tinta da Índia. Um programa de computador analisava as imagens e determinava: a área total da córnea, após a delimitação do seu perímetro pelo operador; a área ocupada pela neovascularização, mediante a identificação dos níveis de cinza que representavam os neovasos rotulados pela tinta da Índia; e o percentual da área de neovascularização em relação à área da córnea. Outros pesquisadores usaram um método semelhante para quantificar angiogênese em córneas submetidas tanto a cauterização (BENELLI et al., 1998; BOCCI et al., 1999; EDELMAN; CASTRO; WEN, 1999; SENNLAUB; CURTOIS; GOUREAU, 1999; PINTO; MALUCELLI, 2002) como a implante de pellets (GU et al., 1999; KLOTZ et
al., 2000; SHAN et al., 2001; WHITE et al., 2003).
Mais recentemente, tornou-se freqüente o uso de marcadores vasculares fluorescentes, como lectinas conjugadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC), que se ligam à célula endotelial vascular (MOROMIZATO et al., 2000; JOUSSEN et
al., 2001; GÖTTE et al., 2002), ou dextrana conjugada com FITC (AUERBACH,
2003; CASTRO; LUTZ; EDELMAN, 2004; HASAN et al., 2004; SAMOLOV et al., 2005), para realçar a neovascularização corneana. Tal abordagem decerto tornar-se- á o método de escolha (AUERBACH, 2003), pois permite uma medida mais precisa da angiogênese (ZICHE, 2001). Para tanto, realiza-se a perfusão do animal, geralmente camundongo, com esses compostos, seguida da enucleação do olho, remoção e montagem da córnea em lâmina. Após isto, a córnea montada é colocada em um microscópio de fluorescência, que propicia o exame dos vasos sangüíneos fluorescentes, os quais são vistos na cor verde. Imagens digitais podem ser obtidas e a área de fluorescência, que corresponde à zona de neovascularização, pode ser mensurada através de processamento de imagens (MOROMIZATO et al., 2000; JOUSSEN et al., 2001; STECHSCHULTE et al., 2001; GÖTTE et al., 2002; MOORE
et al., 2002; CASTRO; LUTZ; EDELMAN, 2004; POULAKI et al., 2004; USUI et al.,
2004; SAMOLOV et al., 2005).
A imuno-histoquímica também pode ser usada para evidenciar a neovascularização corneana. Para tanto, após a remoção e montagem da córnea em lâmina, a peça é submetida a tratamento imuno-histoquímico que utiliza anticorpo contra a molécula de adesão plaqueta-célula endotelial (CD31 / PECAM-1) conjugado com FITC para marcar os vasos sangüíneos. Em seguida, a córnea é colocada em um microscópio de fluorescência, onde imagens digitais dos vasos fluorescentes podem ser obtidas e a área a eles correspondente facilmente
determinada por sistemas analisadores de imagens (AMBATI et al., 2003; CURSIEFEN et al., 2004a; CURSIEFEN et al., 2004b; BISWAS et al., 2005; MARUYAMA et al., 2005).
A enfatização da neovascularização com tinta da Índia ou fluorescência e a subseqüente remoção e preparação da córnea determinam a realização de uma única avaliação. Isto impede observações múltiplas numa mesma unidade experimental, além de requerer um grande número de animais para a implementação dos experimentos. Alguns pesquisadores tentaram contornar esse problema propondo abordagens não invasivas, nas quais o aumento do contraste dos neovasos era obtido mediante o uso de recursos ópticos, propiciando assim medições múltiplas da resposta angiogênica num mesmo animal. Parke et al. (1988) obtinham fotografias da córnea utilizando uma câmera convencional equipada com um filtro verde. Imagens dos negativos das fotografias eram captadas por uma câmera de vídeo conectada a um analisador de imagens que então determinava a área correspondente à neovascularização. Os autores, porém, não relataram como era feito o enquadramento da zona de angiogênese nem como era calculada a área. Conrad et al. (1994) descreveram um método mais completo para aquisição das imagens, realce dos neovasos e subseqüente cálculo da área de neovascularização. A aquisição das imagens era feita por um complexo aparato que propiciava um adequado alinhamento entre a córnea e o dispositivo de captura, mas que requeria a realização de fotografias da zona de angiogênese a cada 15 graus, as quais eram posteriormente montadas para formar uma única imagem. A enfatização dos neovasos era conseguida através do uso de um filtro do tipo passa-banda, que selecionava uma estreita faixa de comprimento de onda de luz, centrada no pico de absorção da hemoglobina, fazendo com que os vasos se tornassem mais escuros contra um fundo claro.
Alternativamente, diapositivos da área de neovascularização corneana podem ser obtidos, os quais são projetados numa folha de papel apropriada. Com uma caneta de cor preta delineia-se manualmente o trajeto dos vasos na folha de papel. Um scanner é então utilizado para a aquisição de imagens digitais da rede vascular manualmente delineada, cuja área é facilmente determinada por sistemas de processamento de imagens (MOHAN et al., 2000).
Eventualmente, imagens digitais da córnea, seja in vivo ou após tratamento para evidenciar a neovascularização, são obtidas e processadas por
softwares com o objetivo de determinar parâmetros próprios dos métodos manuais
de quantificação de angiogênese, tais como: o comprimento vascular radial ou o arco de neovascularização (SENNLAUB; CURTOIS; GOUREAU, 1999; SAITA et al., 2000; SHAN et al., 2001; KON et al., 2003; PINTO; MALUCELLI, 2002; WHITE et al., 2003). Tais imagens também possibilitam o delineamento, com o mouse, do contorno ou perímetro da região de neovascularização corneana, cuja área pode então ser calculada (BENELLI et al., 1998; KLOTZ et al., 2000; SHAN et al., 2001; WU et al., 2003; KUWANO et al., 2004; SAMOLOV et al., 2005). Esta, por sua vez, representa melhor a real área de neovascularização do que as áreas do triângulo, semi-elipse ou do setor de coroa circular anteriormente descritas.