O instrumental utilizado para a aquisição das imagens compreendeu: um microscópio cirúrgico (D.F. Vasconcellos M90, D.F. Vasconcellos S.A., São Paulo – SP) equipado com um divisor de luz e um adaptador para câmera de vídeo, além de um filtro verde; uma câmera de vídeo (Hitachi VCC-151, Japan), instalada no microscópio, analógica, dotada de dispositivo de carga acoplada (CCD – charge-
coupled device), geradora de imagens em cores, com saída de vídeo composto
(composite video) e vídeo separado (S-vídeo: separate video); um monitor vídeo de 20 polegadas (Cineral Eletrônica da Amazônia Ltda., Manaus – AM); um microcomputador com processador Intel® Pentium® III de 500 MHz, memória RAM (random access memory) de 128 megabytes, disco rígido de 20 gigabytes e sistema operacional Windows® Millenium Edition®; um sistema de captura de vídeo (PixelView® PV-TV304P, Prolink Microsystems Corp., Taiwan), instalado no microcomputador, composto por placa de captura de vídeo e software controlador, que possibilitava a captura tanto de vídeo quanto de imagens estáticas.
O procedimento de aquisição foi padronizado de maneira a permitir que a captura das imagens fosse realizada dentro do mesmo enquadramento ou de uma
mesma incidência, seja em animais diferentes, seja na mesma unidade experimental em observações subseqüentes. Para tanto, era fundamental que o microscópio e o dispositivo de acomodação do coelho proporcionassem mobilidade adequada para o enquadramento ideal. O microscópio cirúrgico dispunha de um braço articulado que permitia movimentos nas três dimensões. Uma base de isopor foi preparada para acomodar os animais, os quais eram posicionados em decúbito lateral, direito ou esquerdo. Esta permitia movimentos em todas as direções no plano horizontal, além de rotação do olho em torno do seu eixo e da cabeça em torno do eixo cervical.
O enquadramento ideal deve ser entendido como aquele em que o microscópio e a córnea sejam alinhados de maneira tal que os raios de luz incidam perpendicularmente ao plano tangente à periferia superior da córnea, onde estão localizados o sítio de cauterização e a área de neovascularização. Assim, a distorção espacial decorrente da projeção de uma estrutura curva e tridimensional, como a córnea, numa imagem bidimensional é minimizada (CONRAD et al., 1994; BECKER et al., 1998). De acordo com essa incidência, o campo de visão do microscópio mostrava a região límbica superior na sua porção inferior e a região central da córnea na sua porção superior. Esta mesma disposição foi mantida nas imagens capturadas. Entretanto, o alinhamento perpendicular ocasionou o posicionamento do reflexo luminoso sobre a área de neovascularização. Esse problema foi contornado com a instilação do gel oftálmico ácido poliacrílico, que deslocava o reflexo em direção ao limbo, bem como com um leve aumento do ângulo de incidência, que definitivamente posicionou o reflexo luminoso fora da zona de neovascularização, na região perilímbica. O enquadramento ideal também deve conter, após a obtenção da focalização ótima, toda a região de neovascularização. Ao mesmo tempo, a magnificação deve ser tal que propicie uma adequada identificação da microvasculatura. Isto foi conseguido com um aumento de 25 vezes.
Uma vez estabelecido o enquadramento ideal, os parâmetros que o caracterizam foram obtidos (Figura 9). Com o auxílio de um transferidor, os ângulos entre o eixo do microscópio (reta m na Figura 9) e os eixos x, y e z do sistema de coordenadas tridimensionais foram determinados, quais sejam: 70°, 20° e 90°, respectivamente. O corpo do microscópio foi então fixado nessa angulação. Verificou-se ainda o ângulo entre o plano horizontal e a reta simultaneamente tangente à periferia da córnea e à esclera. Para tanto, utilizou-se um instrumento em forma de “V”, onde o ângulo de abertura determinava que se uma haste fosse
posicionada tangente à córnea, na altura do sítio de cauterização, e à esclera (reta t na Figura 9), a outra se posicionaria paralela ao plano horizontal (reta h na Figura 9). Este ângulo foi medido e correspondeu a 18°. Dessa forma, o ângulo entre o eixo do microscópio e a reta tangente à córnea e à esclera pôde ser calculado, sendo igual a 88° (70° + 18°). A determinação de tais ângulos é importante para futuras reproduções do método. É necessário esclarecer que não foi utilizada a reta tangente à periferia da córnea em virtude da dificuldade em determiná-la. No entanto, essa reta possui uma inclinação um pouco maior que a reta t da Figura 9. Portanto, pode-se deduzir que o ângulo entre o eixo do microscópio e o plano tangente à periferia da córnea é um pouco maior que 90°, o que explica a localização do reflexo luminoso na região perilímbica, ou seja, numa posição inferior no plano de enquadramento. A distância entre a córnea e a objetiva do microscópio foi mantida constante e determinada pela distância focal do microscópio, após a focalização ideal.
FIGURA 9 – Relações angulares entre o eixo do microscópio (m), o plano horizontal (h) e a reta
simultaneamente tangente à periferia da córnea e à esclera (t).
Logo após a definição do enquadramento ideal, foram marcados 4 pontos na tela do monitor, correspondendo a posições estratégicas na córnea e região límbica (Figura 10). O ponto 1 foi posicionado no centro do sítio de cauterização. O ponto 2 foi marcado na linha de transição córneo-escleral, determinando com o
ponto 1 uma reta perpendicular ao plano horizontal. Os pontos 3 e 4 foram marcados próximo aos cantos direito e esquerdo da área de enquadramento, na altura da linha de transição córneo-escleral. Essa abordagem garantia que, em observações múltiplas, a córnea fosse posicionada da mesma maneira, obedecendo à mesma angulação e ao mesmo enquadramento, tendo em vista que o eixo do microscópio era mantido fixo. Assim, foi eliminada a necessidade de se medir o ângulo entre o plano horizontal e a reta simultaneamente tangente à periferia da córnea e à esclera a cada avaliação.
FIGURA 10 – Localização dos 4 pontos de enquadramento na tela do monitor.
O resultado da padronização do processo de aquisição foi a captura de imagens com mínimas variações de enquadramento, tanto as obtidas em diferentes animais quanto aquelas obtidas no mesmo animal, em avaliações subseqüentes (Figura 11). Isto foi fundamental para garantir que a região a ser estudada, ou seja, a área de angiogênese, não sofresse alterações decorrentes de variações na incidência, o que prejudicaria, sobremaneira, o processo de quantificação.
O sistema de iluminação constou de uma lâmpada halógena de 110 V e 150 W, cuja luz era conduzida por fibra óptica até o corpo do microscópio (luz fria), onde passava através de um filtro verde (red free). A iluminação verde é comumente usada para analisar os vasos da retina e da conjuntiva (OWEN et al., 2002), pois aumenta o contraste entre os vasos sangüíneos e as demais estruturas (GIMBRONE
et al., 1974; PARKE et al., 1988). Além disso, elimina o vermelho intenso
característico dos tecidos biológicos, quando estes são iluminados com luz branca. A fonte de luz dispunha de um dispositivo para graduar a intensidade luminosa, de
modo que o mesmo valor foi utilizado em todas as observações e correspondeu à intensidade máxima.
FIGURA 11 – Resultado do procedimento de aquisição das imagens. Notar o enquadramento
semelhante em animais distintos (A e B; C e D) e no mesmo animal em momentos diferentes (A e C; B e D). Magnificação de 25 vezes.
As imagens em cores do olho eram captadas por uma câmera de vídeo analógica acoplada ao microscópio, que dispunha de saída dupla: vídeo composto e vídeo separado (S-vídeo). No vídeo composto, os sinais de brilho e cor são transmitidos em um único condutor, enquanto no vídeo separado essas informações são enviadas por condutores separados, de modo que proporciona uma imagem com qualidade superior quando comparada àquela do vídeo composto. Sendo assim, o sinal da saída de vídeo composto era enviado para o monitor, onde as imagens eram exibidas, possibilitando a obtenção do enquadramento ideal. O sinal da saída S-vídeo, de melhor qualidade, era enviado para a placa de captura instalada no microcomputador. Dessa forma, uma vez definido o enquadramento ideal, imagens estáticas coloridas do olho eram então capturadas, digitalizadas e armazenadas no disco rígido no formato Windows® Bitmap (BMP), com as dimensões de 320 x 240 pixels, correspondendo a 225 kbytes (Figura 12). De acordo com o sistema de digitalização utilizado, cada pixel (picture element), o
elemento básico de uma imagem digital, correspondia a 24 bits (binary digit), sendo as cores representadas segundo o modelo RGB (Red, Green, Blue).
FIGURA 12 – Etapas do procedimento de aquisição das imagens.
O modelo de cores RGB representa cada cor como uma combinação ou uma mistura aditiva das 3 cores primárias: vermelho, verde e azul. Baseia-se, portanto, na natureza aditiva das cores (Figura 13). Esse modelo pode ser representado num sistema de coordenadas tridimensionais como um subespaço de cores na forma de um cubo, onde cada componente de cor corresponde a um eixo ortogonal. As cores são definidas por vetores que partem da origem e se estendem até pontos localizados sobre ou dentro do cubo (Figura 14). Assim, o preto está na origem; o branco está no canto mais distante da origem; as cores primárias vermelho, verde e azul estão nos cantos que coincidem com os eixos; as cores secundárias ciano, magenta e amarelo estão nos outros 3 cantos; e a linha que une os pontos referentes ao preto e branco contém todas as combinações de valores iguais nos 3 componentes e representa a escala de cinza (UMBAUGH; MOSS; STOECKER, 1992; GONZALEZ; WOODS, 2000c; PEREZ, 2001).
FIGURA 13 – Mistura das cores primárias (vermelho, verde e azul) produzindo as cores secundárias
(magenta, ciano e amarelo) e a luz branca.
FIGURA 14 – Cubo de cores do modelo RGB. Os valores de R, G, e B foram normalizados para o
intervalo [0, 1], portanto trata-se de um cubo unitário. Os pontos pertencentes à diagonal principal representam os níveis de cinza, desde o preto na origem, vetor (0,0,0), até o branco, vetor (1,1,1).
O modelo RGB utiliza 24 bits para especificar uma dada cor (1 pixel), sendo 8 bits (1 byte) para cada um dos seus componentes: R (vermelho), G (verde) e B (azul); de modo que pode representar até 28x28x28=224 cores. Dessa forma, uma imagem colorida pode ser decomposta em 3 imagens independentes em tons ou níveis de cinza, correspondendo aos canais R, G e B (Figura 15). O termo nível de cinza refere-se a uma medida de intensidade que varia do preto, passando pelos diversos tons de cinza, até o branco. Em imagens em tons de cinza ou monocromáticas de 8 bits, cada pixel é representado por 8 bits, de modo que pode assumir 28 (256) valores de intensidade, resultando numa escala de 256 tons (escala de cinza), que varia de 0 a 255, onde 0 representa o preto e 255, o branco. Quando
cada pixel é representado por apenas 1 bit, a imagem é dita binária, de modo que pode conter apenas 21 tons: o preto e o branco. Assim, a resolução espectral de uma imagem digital pode variar entre 1 (imagem binária) e 24 bits (imagem colorida) por pixel (PINTO, 1996; GONZALEZ; WOODS, 2000a).
FIGURA 15 – Decomposição de uma imagem colorida nos 3 componentes do modelo RGB. O:
imagem original; R: componente R (Red); G: componente G (Green); B: componente B (Blue). Magnificação de 25 vezes.
O modelo RGB juntamente com o modelo HSI (Hue, Saturation, Intensity) são os mais utilizados em processamento de imagens. O modelo de cores HSI utiliza os atributos matiz, saturação e intensidade para especificar uma cor. A intensidade está associada ao brilho; o matiz relaciona-se com o comprimento de onda dominante em uma mistura de ondas de luz, ou seja, representa a cor dominante que é percebida (cor pura); a saturação refere-se ao grau de diluição de uma cor pura pela luz branca, ou seja, a quantidade desta misturada com o matiz. Saturação e matiz estão intimamente relacionados com o processo de percepção de cor pelo ser humano. Quando tomados conjuntamente são chamados de cromaticidade. Desse modo, uma cor pode ser caracterizada pelo seu brilho e cromaticidade (UMBAUGH; MOSS; STOECKER, 1992; GONZALEZ; WOODS, 2000c). Nesse modelo, o componente I (intensidade) é desacoplado da informação de cor da
imagem ou cromaticidade (matiz e saturação). Assim, ele pode ser processado separadamente sem afetar a percepção de cores (SINTHANAYOTHIN et al., 1999; GONZALEZ; WOODS, 2000c). A Figura 16 mostra a decomposição de uma imagem digital nos componentes H, S e I do modelo HSI.
FIGURA 16 – Decomposição de uma imagem colorida nos 3 componentes do modelo HSI. O:
imagem original; H: componente H (Hue); S: componente S (Saturation); I: componente I (Intensity). Magnificação de 25 vezes.
O sistema RGB pose ser convertido para HSI e vice-versa. No software desenvolvido neste estudo, foi implementado um algoritmo para efetuar essas conversões. Dessa forma, o componente I do padrão HSI, juntamente com os canais
R, G e B do modelo RGB, puderam ser utilizados pelo procedimento de escolha do
canal mais adequado para o processo de conversão das imagens coloridas em monocromáticas.