5. Analysis of case study
5.4 Project team organizational structure: SLS/LT involvement in project
5.4.2 New project structure; increased knowledge flow and lifecycle mindset
Não foram observadas dificuldades na aplicação do acetato de deslorelina. Reações locais, como edema e inflamação decorrentes da aplicação não foram observados, apesar desses efeitos já terem sido relatados após aplicação de implantes de agonistas do GnRH em gatas domésticas (Hebert & Trig, 2005; Toydemir et al. 2012; Ackermann et al. 2012a).
Após a aplicação cinco fêmeas apresentaram comportamento de estro, e nove apresentaram citologia vaginal característica de estro até sete dias após o início do tratamento. Nenhuma fêmea apresentou sinais ou citologia vaginal características de estro após sete dias do início do tratamento contraceptivo. A estimulação ovariana observada após o inicio do tratamento contraceptivo era esperada e foi descrita por diversos autores em fêmeas de felídeos domésticos e selvagens (Munson et al. 2001; Bertschinger et al. 2008; Toydemir et al, 2008; Ackermann et al. 2011; Ackermann et al. 2012a; Ackermann et al. 2012b).
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Não houve complicação anestésica, no procedimento de retirada dos implantes e a cicatrização da ferida cirúrgica ocorreu sem intercorrências. Os implantes foram facilmente palpáveis após 90 dias de tratamento e a remoção foi realizada com facilidade, sem dor ou desconforto. A remoção de implantes de agonistas de GnRH sem dificuldades já foi descrita anteriormente em gatas (Ackermann et al. 2012a; Ackermann et al. 2012b) e cadelas (Wright et al. 2001).
Todas as fêmeas responderam positivamente à indução do estro e ovulação apresentando comportamento e citologia vaginal características do estro. Foram recuperados oócitos de todas as fêmeas do grupo imunoistoquímica, além de serem observados corpos lúteos, confirmando o sucesso do tratamento de indução da ovulação.
Quinze dias após a última cobertura uma gata (G) começou a apresentar apatia, anorexia, poliúria e polidipsia, após realização de hemograma e ultrassonografia foi confirmada a suspeita de piometra. O tratamento escolhido foi a ovariosalpingohisterectomia. A infecção uterina em gatas não é tão frequente como em cadelas, porém pode acontecer. Sabe-se que aplicação de progestágenos exógenos pode aumentar a probabilidade de ocorrência de piometra em gatas (Munson, 2006). Nossos animais chegam adultos ao gatil e muitas vezes sem histórico reprodutivo anterior, sendo difícil predizer os fatores predisponentes envolvidos neste caso. Nenhuma das outras fêmeas apresentou sinal clínico ou ultrassonográfico de hiperplasia endometrial ou piometra, porém 30 dias após a última cobertura não foram visualizadas vesículas embrionárias em nenhuma das fêmeas.
Apesar de não existir relato na literatura relacionando casos de piometra após o uso do acetato de deslorelina em gatas, estudos têm sido desenvolvidos no AZA Wildlife Contraception Center (Saint Louis, EUA) relacionados ao surgimento de
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hiperplasia endometrial uterina em lobas que receberam esse contraceptivo (AZA Wildlife Contraception Center - comunicação pessoal).
Os resultados das análises hormonais estão demonstrados na Figura 1.
Figura 1: Média ± erro padrão da concentração de metabolitos de progesterona (ng/g) em fezes de gatas antes (S-3 a 0), durante (S1 a 12) tratamento com acetato de deslorelina e após término do tratamento contraceptivo, indução de cio e cópula (D1 a 31).
O primeiro relato de gestações após o tratamento contraceptivo com acetato de deslorelina foi feito por Goericke-Pesch et al. (2013). Os autores obtiveram gestação em 7 das 10 gatas tratadas no primeiro cio natural, após o uso de implantes, porém o tempo de retorno à atividade ovariana demorou de 483 a 1025 dias, variando entre os indivíduos. Essa variação individual causado pela deslorelina é um dos problemas mais comuns relacionados ao uso deste contraceptivo, já que uma das características desejáveis de um bom contraceptivo reversível é a sua previsibilidade. Os autores não relataram problemas de parto ou abortos.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Me ta b ó li to s d e p ro ge ste ro n a n g /g fez es
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Em cadelas tratadas com acetato de deslorelina foi observada diminuição da concentração sérica de progesterona após a metade da fase luteal, e mesmo após aplicação de hCG não foi observada a manutenção do CL, sugerindo que os abortos relatados após o uso de acetato de deslorelina podem ter sido induzidos por uma falha luteal gerada pela utilização deste agonista (Wright et al. 2001).
Em nosso estudo, os resultados obtidos na dosagem de progesterona não foram suficientes para elucidar se houve ou não uma falha luteal nessas fêmeas. Aparentemente, metabólitos não progestágenos foram contados como progestágenos, elevando os valores obtidos nas amostras, ou seja o kit utilizado não é válido para esse tipo de amostra.
Apesar da possibilidade de falha luteal, como não foram observadas vesículas embrionárias nos exames ultrassonográficos, possivelmente houve uma falha no transporte ou implantação dos embriões.
A recuperação de oócitos viáveis em gatas domésticas submetidas ao mesmo tratamento contraceptivo e de indução do estro e ovulação foi relatado por nossa equipe (Ackermann et al. 2012a). Nesse mesmo estudo foi observada, em exames histológicos do útero destas gatas, uma marcada hemorragia em lâmina própria que pode ter ocorrido devido à estimulação ovariana excessiva e consequente aumento da concentração de estrógeno gerada pela indução do estro pelas gonadotrofinas exógenas, podendo ser responsável por um ambiente uterino materno desfavorável à implantação embrionária.
Graham et al. (2000) acreditam que a estimulação por gonadotrofinas exógenas pode resultar em um ambiente endócrino materno anormal e consequentemente retardar o transporte embrionário ao útero, existindo portanto a possibilidade do protocolo de indução de estro e ovulação ter influenciado negativamente o transporte espermático ou
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embrionário. Porém, esse protocolo já foi utilizado com sucesso em inseminações artificiais de felinos (Villaverde, 2007).
Tendo em vista que a retirada dos implantes havia ocorrido há mais de 30 dias, optou-se por não castra-las imediatamente. Porém, amostras de úteros de gatas submetidas ao mesmo tratamento contraceptivo (grupo imunoistoquímica) e após 10 dias da indução do estro e ovulação foram avaliadas através de imunoistoquímica.
Em todas as amostras, ER-α e PgR foram imunoexpressos no interior do núcleo das células alvo, apresentando-se em todas as amostras nas células epiteliais, glandulares e estromais. A imunoexpressão de ER-α apresentou declínio discreto quando comparado com os animais controle, sendo verificada em células estromais e células do epitélio uterino. Por sua vez, a expressão de PgR se apresentou complexa e variável, apresentando flutuações extremas de acordo com o animal. Particularmente, o epitélio glandular apresentou diminuição na expressão de PgR, sendo reduzido a quase nulo em alguns animais, enquanto o estroma e o miométrio mantiveram uma expressão significativa de PgR.
A ausência de receptores de progesterona no epitélio de revestimento uterino, mesmo com manutenção da expressão nas glândulas endometriais, foi observada em seres humanos utilizando outros contraceptivos (Stratton et al. 2010). Em éguas (McDowell et al. 1999) observa-se uma variação na expressão desses receptores de acordo com a fase do ciclo, porém ainda não existem dados confirmando se isso também ocorre nas gatas domésticas.
A importância da progesterona na manutenção da gestação é bem conhecida e descrita e, uma vez diminuída a expressão de progesterona no epitélio de revestimento o qual é necessário para a implantação do embrião e início da gestação (Patel et al. 2014),
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uma interferência no processo gestacional é esperada. A hemorragia observada nos exames histopatológicos somada aos resultados obtidos nos exames imunoistoquímicos devem ser considerados como aspectos fundamentais na falha gestacional.
Foi observada a expressão de FSH-R quase que exclusivamente nas células da granulosa dos folículos em desenvolvimento, sendo observada homogeneamente com marcação moderada em todos os animais. Observou-se também que alguns vasos sanguíneos da região medular do ovário apresentaram marcação para FSH-R. Por sua vez, a expressão de LH-R ficou evidente em folículos em desenvolvimento, especialmente nas células da teca em folículos secundários, além de ser observado moderadamente em células intersticiais ovarianas, especialmente sob forma de agregados circulares de células intersticiais. Também foi observada marcação acentuada de algumas células da granulosa de todos os folículos íntegros e de alguns atrésicos (Tabela2).
Tabela 2. Distribuição proporcional da imunoexpressão dos receptores de FSH (FSH- R) e LR (LH-R) no ovário de gatas tratadas com acetato de deslorelina.
FSH-R LH-R
Células da granulosa 100% 17%
Células da Teca 0 100%
Células estromais 89% 100%
Oócitos 0 0
A respeito da expressão de FSH-R e LH-R, demonstrou-se a expressão das proteínas em células previamente especuladas como de expressão natural, observando- se imunoexpressão acentuada em, virtualmente, todos os animais. Acredita-se que tal
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efeito depende da ação da deslorelina, uma vez que já foi previamente demonstrado que há aumento na expressão dos receptores supracitados, elevando seus níveis no ovário após aplicação de agonistas de GnRH (Wei et al. 2013). Entretanto, apesar da indicação do mesmo fato ser visualizado, não é possível afirmar numéricamente a variação na expressão uma vez que para estes receptores a imunoistoquímica funciona como uma análise qualitativa e semiquantitativa, mas não como uma avaliação estritamente quantitativa, sendo necessárias outras técnicas para tal, como a qPCR.
Após 90 dias de tratamento contraceptivo com acetato de deslorelina o retorno à atividade ovariana foi induzido com sucesso, porém não foram obtidas gestações, possivelmente devido a um despreparo uterino após o tratamento contraceptivo. Assim, esse primeiro cio induzido deve ser considerado infértil.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo: 2011/23318-0 e 2012/09002-3) pelo apoio financeiro e à Virbac pela doação dos implantes de acetato de deslorelina.
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Conclusões 51
CONCLUSÕES
A recuperação de COC grau I é afetada negativamente pelo tratamento com acetato de deslorelina em gatos domésticos.
Há um efeito individual na produção in vitro de embriões após o tratamento contraceptivo com acetato de deslorelina.
O primeiro estro induzido após o tratamento contraceptivo deve ser considerado infértil.
O tratamento de curta duração com acetato de deslorelina não afeta a expressão de receptores de FSH e LH no ovário e de receptores de estrógeno no útero. O tratamento de curta duração com acetato de deslorelina afeta a
imunoexpressão de progesterona no útero de gatas, sendo o possível responsável pela falha gestacional após o tratamento.