Distribution of authority in SLS

Vinte e cinco gatas domésticas, sem raça definida (2 a 3 anos) foram utilizadas nesta pesquisa. Quinze fêmeas (grupo gestação GG n=5 e imunoistoquímica GI n=10) e um gato macho foram mantidos no Gatil Experimental da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu, Brasil. Os gatos foram mantidos com um mínimo de 12 horas luz/dia e pelo menos 150 lux. Os animais eram alimentados com ração comercial (Premier Gatos Adultos, Dourados, Brasil) e água à vontade. As outras dez fêmeas pertenciam a proprietários (grupo Controle n=10).

Antes do início do projeto, todos os animais do gatil foram vacinados contra viroses felinas (herpesvirus, calicivirus, panleucopenia) e raiva. Exames ultrassonográficos foram realizados para exame geral e do trato reprodutivo.

2.2 Monitoramento do ciclo estral

As fêmeas do grupo tratado tiveram seu ciclo estral acompanhado através de exames de citologia vaginal e de comportamento sexual. As avaliações foram conduzidas a cada 72 horas por um único observador, treinado, entre 09:00 e 10:00 da manhã, como descrito previamente por Ackermann et al. (2012a). As células vaginais foram classificadas de acordo com o critério proposto por Johnston et al. (2001).

Capítulo II 37

2.3 Tratamento contraceptivo

Quando as fêmeas do GG e GI apresentavam-se em interestro ou diestro (Dia 0), evidenciada pela presença de <70% de células epiteliais superficiais, um implante de acetato de deslorelina (Suprelorin®_{, Virbac, Carros Cedex, França; 4,7 mg/animal) foi} inserido no tecido subcutâneo na região interescapular, após tricotomia e limpeza da área (Ackermann et al. 2012a). Não foi necessário sedar nenhum animal experimental para o procedimento.

Após o início do tratamento, as gatas foram monitoradas semanalmente através de citologia vaginal, comportamento reprodutivo e dosagens hormonais durante 90 dias.

2.4 Término do tratamento contraceptivo, indução do estro e ovulação

No Dia 90 as fêmeas foram submetidas a um protocolo anestésico utilizando cetamina (Dopalen®_{, Vetbrands do Brasil, Paulínia, Brasil; 15 mg/kg; IM) e xilazina} (Xilazin®_{, Syntec do Brasil, Cotia, Brasil; 1 mg/kg; IM) para remoção cirúrgica do} implante.

Dez dias após a retirada da deslorelina, as gatas foram submetidas ao protocolo de indução do estro e ovulação: gonadotrofina coriônica equina (eCG) (Novormon®_, Vetrepharm, Canadá; 100 IU/gata; IM) e 84 horas após gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Vetecor®_{, Laboratórios Calier, Espanha; 100 IU/gata; IM) (Villaverde. 2007).} Os animais foram então divididos em dois grupos: grupo gestação e grupo imunoistoquímica.

Capítulo II 38

2.5 Grupo gestação

Vinte e quatro horas após a indução da ovulação, cinco gatas foram mantidas com um macho comprovadamente fértil e submetidas à monta natural; foram permitidas cinco coberturas.

Foram realizadas coletas de fezes a cada 48 horas para dosagens hormonais de progesterona, até o momento do diagnóstico de gestação. A presença ou não de vesículas embrionárias foi verificada 30 dias após a última monta através de ultrassonografia.

Para dosagem de progesterona foram coletadas amostras de fezes a cada sete dias. As amostras foram armazenadas em freezer -14ºC e posteriormente liofilizadas e os metabólitos de progesterona extraídos (Graham et al. 2001). A dosagem de progesterona foi realizada utilizando kits comerciais em fase sólida (Immunotech, França) e leitura por sistema de radioimunoensaio [Packard Cobra II Auto Gamma (GMI Inc. – Minnesota – USA)], seguindo as instruções do fabricante.

2.6 Grupo imunoistoquímica

Três dias após a indução da ovulação, dez fêmeas foram anestesiadas e submetidas à ovariosalpingohisterectomia (OSH). O útero e ovários de cada fêmea foram imerso em formol tamponado 10% por 24 horas e depois mantidos em álcool 70% até o momento de inclusão em parafina para posterior análise por imunoistoquímica. As cinco fêmeas provenientes de proprietários foram submetidas às OSH e o útero e ovários foram tratados como descrito anteriormente e serviram como grupo Controle nas análises de imunoistoquímica.

Capítulo II 39

2.7 Grupo Controle

As fêmeas do grupo controle não foram submetidas a nenhum tipo de tratamento contraceptivo ou hormonal. Todas foram castradas e o útero e ovários de cada fêmea foram imersos em formol tamponado 10% por 24 horas e depois mantidos em álcool 70% até o momento de inclusão em parafina para posterior análise por imunoistoquímica

2.8 Análise imunoistoquímica

A imunoistoquímica foi avaliada por meio de microscopia de luz, sendo utilizados anticorpos anti FSH-R, LH-R, receptor de progesterona (PgR) e receptor de estrógeno (ER-α). Para cada amostra foi avaliada a expressão qualitativa nas células ovarianas da teca, da granulosa, germinativas e estromais nos ovários e miométrio, epitélio glandular e de revestimento e estroma uterinos.

Foram obtidos cortes histológicos de 3 µm de espessura a partir dos blocos parafinados contendo os fragmentos teciduais, cortes estes aplicados sobre lâminas carregadas positivamente (Positive charged adhesion slides – Amitel, Brasil). As lâminas foram desparafinadas e submetidas a processo de recuperação antigênica utilizando-se a solução de recuperação específica (Trilogy, Cell Marque, Rocklin, Estados Unidos) e câmara de pressão microprocessada (Pascal Pressure Chamber, Dako, Carpinteria, Estados Unidos), a qual aqueceu as amostras sob pressão. Após a retirada do material da câmara de pressão, as lâminas foram lavadas utilizando-se a solução de recuperação e posteriormente submetidas a bloqueio proteico e da atividade da peroxidase endógena por meio de soluções disponibilizadas em um kit/sistema de

Capítulo II 40

visualização para imunoistoquímica baseada em polímero (NovoLink Polymer Detection System, Novocastra, Newcastle, Inglaterra).

Subsequentemente, as lâminas foram imersas em solução de peróxido de hidrogênio a 3% diluído em metanol para bloqueio da atividade de peroxidase endógena por 20 minutos, seguido de bloqueio de proteínas inespecíficas por 20 minutos. Na sequência, aplicaram-se nas lâminas anticorpos primários dispostos na Tabela 1 e incubados a 4º C overnight.

Para fins de controle positivo, foram utilizados testículos de felinos (para LH-R e FSH-R) e tecido uterino de felino reconhecidamente positivos para ER-α e PgR, bem como os próprios tecidos que foram utilizados como controles internos. Para fins de controle negativo, os anticorpos primários foram substituídos por IgG de camundongo e de coelho (Dako, Carpinteria, EUA).

Tabela 1. Anticorpos primários utilizados e suas especificações

Anticorpo Clonalidade Diluição Fonte Fabricante

ER-α 1D5 1:50 Camundongo Dako, EUA

PgR Policlonal 1:50 Coelho Neomarkers,

EUA

FSH-R Policlonal 1:100 Coelho Santa Cruz

Biotechnology, EUA

LH-R Policlonal 1:200 Coelho Abcam,

Inglaterra ER: receptor de estrógeno; PgR: receptor de progesterona; FSH-R: receptor de hormônio folículo-estimulante; LH-R: receptor de hormônio luteinizante

Capítulo II 41

2.9 Análise estatística

A concentração de metabólitos fecais de progesterona foram expressos em média ± erro padrão e os resultados foram descritos subjetivamente.

Para avaliação estatística com fins comparativos, foi utilizado o teste exato de Fisher, com tabelas de contingência 2x2 para avaliar diferenças entre os grupos avaliados. As diferenças foram consideradas estatísticamente significativas quando p<0,05. O software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, Estados Unidos) foi utilizado para análise estatística.